РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
Виконані дослідження є складовою частиною тематичного плану науково-дослідних робіт Інституту овочівництва і баштанництва УААН.
Весь обсяг лабораторних досліджень по культурі тканин і клітин in vitro капусти білоголової був проведений на базі відділу клітинної селекції Інституту клітинної біології і генетичної інженерії НАН України (м. Київ), а також лабораторії біотехнології Інституту овочівництва і баштанництва УААН. Досліди по RADP аналізу проведено на експериментальній базі лабораторії генетики Інституту свинарства УААН (м. Полтава), білкові дослідження у лабораторії біотехнології Інституту рослинництва ім. Юр'єва (м. Харків).
2.1. Вихідний рослинний матеріал
У дослідах використовували види рослин родини Brassicacea і Solanaceae.
1. Капуста білоголова (Brassica oleracea L. var. capitata L.). Пізньостиглі сорти селекції Інституту овочівництва і баштанництва УААН: Хаpькiвська зимова (Кн. 8990), Українська осінь (Кн. 8155), Ярославна (Кн. 9168), Ліка (Кн. 9124), Білосніжка (Кн. 7921), Леся (Кн. 9567). Ранньостиглий сорт німецької селекції Dithmarscher Fruher (Дітмаршер Фрюер (каталог світової колекції, вип. 221, 1978)) насіння отримане на Сквирській селекційний станції Інституту овочівництва та баштанництва УААН. Ранньостиглий сорт Іюнська рання (Каталог ВІР 3200, Росія), насіння люб'язно надане кандидатом сільськогосподарських наук Т.В. Чернишенко (Інститут овочівництва і баштанництва УААН).
2. Ріпак яровий (Brassica napus L.), сорт Шпат, насіння надане Інститутом олійних культур УААН (м. Запоріжжя, Україна).
3. Дикий вид орабідопсис (Arabidopsis thaliana L. cv. Columbia). Насіння люб'язно надане кандидатом біологічних наук Т.П. Пастернаком (Інститут клітинної біології і генетичної інженерії НАН України).
4. Редька столова (Raphanus sativus L.), сорт Одеська-5, насіння отримане в торгівельній мережі фірми "Сортнасіннєовоч".
5. Тютюн (Nicotiana tabacum L.), лінія SR-1 [205], пробіркові рослини, одержані з відділу клітинної селекції Інституту клітинної біології та генетичної інженерії НАН України.
6. Картопля (Solanum tuberosum L.), сорт Зарево селекції Інституту картоплярства (м. Немішаєво, Україна), пробіркові рослини, одержані з відділу клітинної селекції Інституту клітинної біології та генетичної інженерії НАН України.
Підтримання колекції рослин родини Brassicacea, задіяних в експериментальній роботі проводили шляхом мікророзмноження, використовуючи культуру тканин з сегментами пазушних бруньок або експлантів гіпокотилів.
Для приготування рослинного матеріалу насіння вищевказаних сортів капусти білоголової, ріпаку ярового і редьки поверхнево стерилізували в асептичних умовах послідовним зануренням спочатку у 70 % розчин етанолу (1 хв.), а потім у водний розчин (3:1) промислового відбілювача "Білизна" (15-20 хв.), що вміщував 0,1 % Tween 20. Далі насіння тричі відмивали у стерильній дистильованій воді протягом 10-20 хв., висаджували на безгормональне живильне середовище МС (Мурасіге і Скуга, 1962) і розміщували у темряві для пророщування при 25 оС. Протягом 7-9 діб культивування пророщене насіння формувало стерильні рослини з надмірно подовженими етіольованими гіпокотилями. Гіпокотилі з пророщеної розсади розрізали на сегменти довжиною 5-7 мм і висаджували на агаризоване живильне середовище ШХмод3 (див. досліди підрозділу 6.1), доповнені або еталонними (БАП, кінетін, зеатин), або піридиновими регуляторами цитокінінової дії (ДГ-466, ДГ-482 і ДГ-735) у концентрації 1 мг/л. Для індукції органогенезу адвентивних пагонів до 15 експлантів гіпокотилів розміщували на одну чашку Петрі з живильним середовищем. Культивування експлантів проводили в умовах 16-годинного фотоперіоду на розсіяному світлі з низькою інтенсивністю (500 люкс) і при температурі 25 оС. Мікророзмноження живцюванням проводили на агаризованому живильному середовищі ШХмод3 з комбінованим вмістом ауксину - НОК (0,1 мг/л) і цитокініну БАП (0,25 мг/л). При цьому, умови освітлення і температури при культивуванні мікроживців були такими ж, як і при вирощуванні вегетативного потомства в культурі експлантів гіпокотилів.
Для приготування живильних середовищ використовували заздалегідь приготовлені концентровані вихідні розчини регуляторів росту, розчинені в універсальному розчиннику ДМСО (диметилсульфоксиді) із розрахунку 1 мг речовини на 1 мл розчинника. Додавання регуляторів у живильні середовища проводили в асептичних умовах після автоклавування і охолодження останніх до 40-50 оС.
При проведенні досліджень враховували статистичний показник формування вегетативного потомства: коефіцієнт розмноження (КР) - кількість утворених адвентивних пагонів на один культивований експлант тканини. Для підрахунку КР застосовували статистичний метод оцінки результатів досліджень, який враховував дискретне варіювання цієї контрольованої ознаки.
Мікророзмноження тютюну, картоплі і орабідопсису проводилося згідно методик, раніше запропонованих для цих видів рослин [206, 207].
2.2. Виділення та культивування протопластів представників родини Brassicacea і Solanaceae
В дослідах по культивуванню протопластів використовували рослини, які вирощували в умовах in vitro капусти білоголової сортів Хаpькiвська зимова, Українська осінь, Ярославна, Ліка, Білосніжка, Леся, Дітмаршер Фрюер, Іюнська рання; редьки столової сорту Одеська-5; ріпаку ярового сорту Шпат. Мезофільні протопласти ріпаку ярового, редьки столової, тютюну, картоплі і орабідобсису використовувались тільки у досліді по вивченню екзогенного гібереліну ГК3, представленому у підрозділі 4.3.
2.2.1. Виділення та культивування протопластів капусти білоголової, ріпаку ярового і редьки столової. Протопласти мезофілу листа одержували або з 3-4-тижневої розсади, або з мікроклонально розмножених ювенільних рослин, що мали добре розвинуту листкову поверхню. Гіпокотильні протопласти виділяли з етіольованої розсади 7-9 днів культивува