РОЗДІЛ 2.
МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ.
Клінічні дослідження виконувалися на кафедрі анестезіології та інтенсивної
терапії Запорізького інституту удосконалення лікарів, імунологічні дослідження
проведені на кафедрі імунології і біохімії в лабораторії імунології клітинних
популяцій Запорізького державного університету (науковий керівник - зав. каф.,
проф., док. мед. наук Фролов О.К.).
Дані, використані в значенні контролю, отримані при обстеженні 10 здорових
донорів молодого віку (співробітники ЗДУ). Дана група обстежених була
однотипною за віком та статтю.
2.1. Характеристика клінічного матеріалу
У 34 хворих вивчався вплив операційної травми на функціональний стан імунної
системи. Відповідно до методів анестезіологічного забезпечення хворі були
поділені на 5 груп. Клінічна характеристика хворих в основних клінічних групах
за віком подана в таблиці 2.1.
Таблиця 2.1
Розподіл хворих у залежності від віку та виду анестезіологічного забезпечення
Вік
АА
НЛА
ЗНД
ВППН
ЕО
Усього
До 20 років
20-30 років
31-40
41-50
11
51-60
Більше 60 років
РАЗОМ
34
АА - атаралгезія; НЛА - нейролептаналгезія; ЗНД - збалансований наркоз
диприваном; ВППН - внутрішньовенний програмований полінаркоз; ЕО -
електрознеболення.
Всі досліджувані групи клінічних спостережень є репрезентативними за віком та
об'ємом оперативних втручань.
У всіх хворих на основних етапах знеболювання, хірургічного лікування й у
найближчому післяопераційному періоді визначалася концентрація кортизолу і
гормонів тиреоїдного комплексу. Імунологічний статус вивчався з використанням
цитоморфометричного, авідного розеточного, люмінесцентного методів, і також
проводився аналіз лейкоцитарної формули крові.
Усі ці показники реєстрували на наступних етапах загальної анестезії і
хірургічного лікування: 1-й етап - контроль (вихідний стан), 2-й етап – 30-40
хвилин після премедікації; 3-й етап - через 30-40 хвилин після індукції й
інтубації трахеї; 4-й етап - травматичний етап операції; 5-й етап - кінець
операції; 6-й етап - наступний день після операції; 7-й етап - тиждень після
операції.
2.2. Авідний розеточний метод
Постановка авідного розеточного методу збігається з методом кількісного
визначення Т-лімфоцитів, який заснований на спонтанному приєднанні ЕБ. У
клінічній практиці найбільш часто використовується мікрометод з суцільної крові
[134]. Ми пропонуємо застосовувати його в модифікації, що полягає в додаванні
до культурального середовища, що має в наявності, 20% ЕТС замість аутоплазми,
або гетерогенної сироватки. Важливість такої модифікації полягає в наступному.
По-перше, з аутоплазмою і чужорідною сироваткою із системи елімінуються можливі
інгібітори або стимулятори розеткоутворення. По-друге, що особливо важливо,
білки ЕТС створюють у середовищі онкотичний тиск для оптимальної
ліганд-рецепторної взаємодії між ЕБ та Т-лімфоцитами. Тому більш вірогідно
виявляється авідна до ЕБ різноманітність Т-лімфоцитів, а, отже, підвищується і
чутливість методу. При постановці методу тільки на культуральних середовищах
без додавання сироваток, що часто має місце в клінічних і експериментальних
лабораторіях, показники Е-РУК знижуються на 15-20 %.
Лімфоцити одержували виділенням на фікол-верографиновому градієнту щільності
[134]. Осад лімфоцитів відмивають розчином Хенкса (3 мл), ретельно видаляють
надосадочну рідину, а осад ресуспендують у живильної суміші (середовище 199,
20% ЕТС) до концентрації клітин 2х106/мл.
Паралельно з одержанням суспензії лімфоцитів готують розчин 0,5% еритроцитів
барана 0,5% на такий же за складом живильної суміші; 0,2 мл її додають до 0,2
мл суспензії лімфоцитів. Клітини центрифугують 5 хв. при 1000 про/хв. для
наближення ЕБ до лімфоцитів, інкубують 10 хв. у термостаті при 370С, далі - 1
годину в холодильнику при +40С. Розетки, що утворилися, фіксують додаванням 0,1
мл 3% розчину глютарового альдегіду (кінцева концентрація - 0,6%) протягом 20
хв. при кімнатній температурі. Клітини відмивають 5 мл дист. води, осад
ресуспендують у 0,2 мл рідини, що залишилися; 2-3 краплі суспензії наносять на
знежирене предметне скло і поширюють на 1/3 їхньої площі. Мазку дають висохнути
в горизонтальному положенні. Фарбують 10% розчином Гімза 10-15 хв. з наступним
диференціюванням.
При аналізові препаратів у 5-ти різних місцях препарату вивчають 200
лімфоцитів, класифікуючи їх за здатность утворювати спонтанні розетки з ЕБ
(Т-лімфоцити), а серед останніх враховують авідність за кількостю ЕБ, що
прикріпилися до лімфоциту. Обчислюють відносну та абсолютну кількість Е-РУК як
при загальноклітинному методі і додатково до нього - абсолютну та відносну
кількість високоавідних активованих Т-лімфоцитів, що відносяться до КЛ ? 8 ЕБ.
З застосуванням ЕТС показники Е-РУК у здорових донорів 62,2±3,6% (55-75%);
1,04±0,17 x 109 (0,8±1,25 x 109 од./л); високоавідних активованих Е-РУК -
27,8±2,1%; 0,46±0,04 x 109 од./л (0,3-0,52 x 109 од./л.).
З застосуванням моноклональних антитіл (МКАТ) для визначення кількості Т- і
В-лімфоцитів та їх субпопуляцій, авідний розеточний метод з ЕБ та інші
розеточні методи не повинні загубити своєї клінічної значимості, тому що
відбивають функціональний стан типу "рецептор-ліганд" досліджуваної клітинної
структури. МКАТ тестують клітини по одному з эпітопів даної структури, часто не
пов'язаного з її активним центром. Водночас, показано, що в процесі синтезу
ферментних або рецепторних структур в їх активних центрах виникають дефекти, що
перешкоджають зв'язуванню з їх специфічними лігандами. Наприклад,
- Київ+380960830922