РОЗДІЛ 2
МАТЕРIАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛIДЖЕННЯ
2.1. Опис експериментального матеріалу
2.1.1. Характеристика експериментальних тварин
Досліди проводились на 92 статевозрілих самицях мишей лінії C57Bl/6, вагою
18-22 г, розводки віварію ІЕПОР ім. Р.Є.Кавецького НАН України, керуючись
міжнародно прийнятими правилами проведення робіт з експериментальними
тваринами. В роботі було використано перещеплювальний штам карциноми молочної
залози Са755, отриманий з Банку клітинних культур ІЕПОР ім. Р.Є.Кавецького НАН
України. Для ведення штаму штаму використано 22 тварини. Для дослідів пухлину
перещеплювали внутрим’язево, вводячи тварині 5 млн. клітин. В кожному досліді,
яких було шість, тварин поділяли на 2 групи (по 5-6 тварин в кожній групі):
контрольна (нелікована) та тварини, що отримували a-ДФМО в дозі 500 мг/кг.
Препарат вводили в черевну порожнину.
Також проведено п’ять дослідів на 68 безпородних щурах, вагою 130-150 г з
карциносаркомою Уокер (W-256). Для ведення штаму використано 14 тварин. Пухлину
перещеплювали підшкірно, в розрахунку 5-7ґ106 клітин/тварину в 0,1 мл
фізіологічного розчину. Щурів поділяли на дві групи (по 5-6 тварин в кожній
групі). Перша група – контрольні тварини (неліковані). Друга – тварини, що
отримували інтраперітоніальні ін’єкції a-ДФМО в дозі 500 мг/кг маси (в першому
досліді), або 1000 мг/кг маси (в наступних дослідах).
Початкову ін’єкцію a-ДФМО тваринам робили в день появи першої пальпаторно
реєстрованої пухлини, другу та третю – на наступні дві доби. Через добу після
останньої ін’єкції тварин присипляли ефіром, пухлину видаляли, зважували та
використовували для приготування ядерних і клітинних екстрактів.
Процент гальмування росту пухлини визначали за змінами маси пухлини за
формулою:
,
де N – процент гальмування росту пухлини,
mk – маса пухлини в контролі,
me – маса пухлини в досліді [14].
2.1.2. Культура клітин
Досліди також проводили на клітинній лінії раку молочної залози людини MCF-7,
одержаній з Банку клітинних культур ІЕПОР ім. Р.Є.Кавецького НАН України.
Клітини лінії MCF-7, згідно з даними літератури, отримані з ексудативної рідини
у жінки з метастазами РМЗ у плевру [167]. Для даної лінії характерний слабкий
інвазивний та метастатичний статус, наявність експресії рецепторів до
естрогенів та прогестерону.
Було проведено 5 експериментів. Клітини культивували на середовищі
Dulbecco-ISCOV (“Sigma”, США) з додаванням 10% ембріональної телячої сироватки
("Сяйво”, Львів, Україна) та антибіотику гентаміцину в концентрації 40 мкг/мл
при температурі 37оС та при насиченні повітря 5% СО2 в культуральних флаконах
об’ємом 150 см3 (“Sigma”), що містили 20 мл середовища. Початкова концентрація
клітин становила приблизно 106 клітин на флакон. Через 72 години після пересіву
клітин культуральне середовище видаляли і вносили у флакони нову порцію чистого
середовища (2 флакона в кожному експерименті), або середовище з додаванням 5мМ
a-DFMO (2 флакона), або середовища з додаванням 5мМ a-DFMO та 5ґ10-7M
путресцину (2 флакона). З цими агентами клітини культивували протягом 72 годин,
механічно збирали, двічи промивали ізотонічним розчином NaCl і використовували
для приготування ядерних та клітинних екстрактів.
2.2. Характеристика онкологічних хворих
Дослідження активності ОДК і вмісту ПА в пухлинах проведені на операційному
матеріалі, видаленому у 52 хворих з пухлинами молочної залози віком 37-62 роки,
які перебували на лікуванні в Інституті онкології АМН України.
Хворі на РМЗ (36 пацієнток) були розділені на групи відповідно до встановленої
у них клінічної стадії. При цьому у 26 пацієнток була виявлена ІІ стадія; у 10
- ІІІ стадія. Передопераційної протипухлинної терапії хворим на РМЗ не
проводили. При гістологічному аналізі операційного матеріалу у хворих на РМЗ
виявлені такі типи злоякісних пухлин: скирозний рак (11), залозистий рак
(інфільтруючий – 19, неінфільтруючий – 3, інфільтруючий з низькою
диференціацією – 3).
У 16 пацієнток виявлені доброякісні пухлини. У хворих з доброякісними
захворюваннями були діагностовані фіброаденоми (9 випадків) та локалізований
вузловий фіброаденоматоз (7 випадків).
Дослідження ПА сечі проведені у 70 хворих віком 29-67 років. У 54 пацієнток
були виявлені злоякісні пухлини молочної залози; у 16 –доброякісні.
Як матеріал для статистичного дослідження наявності зв’язку між вмістом ПА і
тривалістю життя пацієнтів було використано дані по вмісту ПА у сечі 57 хворих
на РМЗ віком 35-65 років, які перебували на лікуванні в Інституті онкології АМН
України. Відомості про тривалість життя хворих на РМЗ було зібрано за даними
архіву Інституту онкології АМН України. Вміст ПА було визначено к.б.н., с.н.с.
відділу біохімії пухлин ІЕПОР ім. Р.Є.Кавецького НАН України Залєток С.П.
Пацієнтки були згруповані залежно від подальшої тривалості життя у три групи:
до першої групи увійшли пацієнтки, що прожили більше десяти років після
встановлення первинного діагнозу (31 хвора). До другої групи – пацієнтки, що
прожили від 5 до 10 років після встановлення первинного діагнозу (14 хворих).
Третю групу склали 12 хворих, що померлі в перші 5 років після встановлення
первинного діагнозу. Сечу хворих для аналізу збирали в період ремісії після
оперативного видалення первинної пухлини.
2.3. Біохімічні методи дослідження
Визначення вмісту ПА. До досліджуваних зразків (гомогенатів, екстрактів)
об’ємом 1,5 мл додавали рівні об’єми 20% ТХУ, перемішували та залишали на ніч
при -12ОС. Осад, що утворився, видаляли за допомогою центрифугування зі
швидкістю 3 тис. об/хв. протягом 15 хв. рН супернатанта доводили до 9,5-10 за
допомогою Na2CO3. До кожного зразка додавали
- Київ+380960830922