РОЗДІЛ 2
МЕТОДИКА ДОСЛІДЖЕНЬ
2.1. Об'єкт дослідження.
В якості моделі для вивчення модулюючого впливу змін позаклітинної концентрації
іонів калію на властивості потенціал-керованої калієвої провідності була
використана лінія клітин феохромоцитоми щура РС-12.
Лінія клітин феохромоцитоми щура PC-12 є клітинною лінією нейронального
походження. Ця нейросекреторна лінія являє собою трансформовані хромафінні
клітини, що були отримані методом клонування злоякісної пухлини мозкового шару
кори надниркової залози щура [112]. PC-12 є зручною моделлю для вивчення
процесів, що протікають у нервовій тканині, оскільки клітини PC-12 можуть
необмежено ділитися in vitro, диференціюватися під дією певних факторів та
набувати деяких властивостей, притаманних зрілому симпатичному нейрону:
утворювати нейрити, синтезувати та секретувати за допомогою екзоцитозу
нейротрансмітери [112]. Потенціалкерована калієва провідність клітин PC-12 є
домінуючою, що дозволяє використовувати ці клітини як адекватну модель для
дослідження впливу змін позаклітинної концентрації іонів калію на властивості
потенціал-керованої калієвої провідності.
Культивування клітин феохромоцитоми PC-12 здійснюється за методикою, яка
описана в роботі [112]. Клітини РС-12 вирощували в моношарі в пластикових
флаконах Карреля (25 мл) і пасивували через кожні 3-4 доби у співвідношенні
1:3. Середовище культивування: 85% RPMI-1640 (Sigma, USA, pH=7,4) с 10%
термоінактивованої конячої сироватки (Sigma, USA) та 5% ембріональної сироватки
великої рогатої худоби (Sigma, USA).
Культуру клітин вирощували в СО2-інкубаторі в зволоженому газовому середовищі з
5% СО2 при температурі +370С. Для досліджень клітини механічно знімали з
флакона в кінці лагперіоду (приблизно 24 години), поміщали в пластикові чашки
Петрі (5мл) та культивували близько однієї години для прикріплення клітин до
субстрату чашки. Перед дослідженнями культуральне середовище замінювалося на
відповідний розчин.
Мембрана недеференційованих клітин РС12, що культивувалися в стандартних умовах
– незбудлива [113]. Та при культивуванні з факторами, що викликають
диференціювання (NGF) Na+-струм зростає в 5-7 разів, внаслідок чого клітини
стають спроможними генерувати потенціали дії [114].
У недеференційованих клітинах РС12 експресуються гени натрієвих каналів типу II
і не експресуються гени натрієвих каналів типу I. Фактори, що викликають
диференціювання збільшують експресію генів натрієвих каналів типу II і не
впливають на експресію генів натрієвих каналів типу I. Збудливість
диференційованих клітин PC-12 пояснюється специфічною індукцією генів натрієвих
каналів типу II під час диференціювання. Дослідження показали, що при
диференціюванні активується цАМФ-залежна протеїнкіназа, яка стимулює експресію
генів натрієвих каналів типу II і IIA [115].
У мембрані клітин PC-12 було ідентифіковано 5 типів калієвих каналів. Два з них
– це: калієві канали з низькою провідністю (близько 14 пСм), кальцій-активовані
калієві канали з швидкою інактивацією (близько 102 пСм) і два типи калієвих
каналів з подібною провідністю (близько 20 пСм). Два останні типи калієвих
каналів відрізняються кінетикою процесу інактивації: одному типу каналу
притаманна повільна інактивація, інший належить до родини швидких K+-каналів.
У геномі клітин PC-12 були ідентифіковані альфа-субодиниці двох калієвих
каналів з родини Shaker (Kv1.2 та Kv1.3), що повільно інактивуються, а також
калієві канали Kv2.1, Kv3.1 and Kv3.2 [32].
Калієві канали з родини Shaker Kv1.2 є O2-чутливими. Пригнічення цих каналів
викликає деполяризацію мембрани і зростання концентрації внутрішньоклітинних
іонів кальцію [32].
Активатори протеїнкінази С не впливають на затриманий швидкий K+-струм [116].
У розвитку вихідного калієвого струму можна виділити 3 фази: швидка активація,
повільна інактивація, стаціонарний рівень. Можна відзначити, що швидкості
активації та інактивації потенціалзалежні і збільшуються при деполяризації, для
опису інактивації необхідно 2 експоненти. Стаціонарний рівень росте при
деполяризації і при підвищенні концентрації внутрішньоклітинних іонів Са2+.
Струм починає активуватися при потенціалі –40 мВ і досягає насичення при
потенціалі 40 мВ. Він може мати локальний максимум при потенціалі 10 мВ і
обумовлений активацією Са2+-залежних калієвих каналів іонами Са2+, що надходять
через потенціал-активовані Са2+-канали, моменту відкривання яких відповідає
вигин вольт-амперної характеристики [117].
При реєстрації струмів від цілої клітини помітні два типи потенціал-керованих
калієвих каналів, що розрізняються за кінетикою та вольт-амперними
характеристиками. Провідності цих каналів приблизно однакові і складають
близько 25 пСм [118].
Стаціонарний струм, що не інактивується, переноситься через Са2+-залежні
калієві канали високої провідності, які мають високу залежність активації від
мембранного потенціалу. Вони цілком і зворотно блокуються 5 мМ ТЕА,
прикладеного зовні. Їх вольт-амперні характеристики лінійні на ділянці ±100 мВ,
провідність складає близько 220 пСм [118].
В клітинах експресуються потенціал-керовані калієві канали чотирьох типів
(надалі 1-4). Канали всіх чотирьох типів чутливі до тетраетиламонію. Канали
типів 1 та 2 чутливі до 4-амінопіридину і їх відповідні часи інактивації
складають близько 60 та 400 мс. Канали типів 3 та 4 майже не інактивуються
[119].
Щільність калієвого струму, розрахована на одиницю ємності, для клітин, що
культивувалися з NGF, перевищувала аналогічний параметр для клітин контролю в
півтора-два рази при амплітуді деполяризуючого імпульсу +50 мВ та
підтримуваном
- Київ+380960830922