РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ
2.1. Матеріали дослідження
Предметом дослідження у даній роботі були розчинні та філаментні поліпептиди ГФКБ з різних відділів головного мозку щурів лінії Wistar. Досліди проводилися на статевозрілих (8-12 місяців) щурах масою 170-210 г обох статей. Загальна кількість тварин, задіяних у експерименті - 128. Тварини утримувалися в пластикових садках у кількості не більше 5 у клітці при температурному режимі 20-23 оС, стандартних умовах із циклічністю доби: світло - 12 годин, ніч - 12 годин та стандартній дієті для гризунів [143]. Їжа для тварин готувалася виключно у скляному і пластиковому посуді для запобігання її контамінації металами. Дослідження були проведені з використанням хімічночистих реагентів фірм Sigma, Serva, Shleich & Shuell Inc., Santa Cruz Biotechnology (США), Fluka (Швейцарія), ANAWA, Merck (ФРН), Litex (Данія), Реагент (м. Дніпропетровськ, Україна), фармакопейних препаратів фірми "Дарниця" (м. Київ, Україна).
2.2. Експериментальні моделі
1. Дослідження хронічного впливу хлориду алюмінію (AlCl3), малих доз іонізуючого випромінювання та їх сумісної дії.
Контрольна і п'ять експериментальних груп складалися із 7-8 тварин кожна. Експериментальні групи були такими: у групах 1-3 щури отримували сумарну дозу рентгенівського випромінювання 12,9 мКл/кг фракціоновано протягом 7, 14 або 21 дня (відповідно 1,89 мКл/кг, 0,92 мКл/кг та 0,61 мКл/кг за сеанс); у групі 4 щури отримували у питній воді AlCl3 (0,2%-ий розчин); у групі 5 - також 0,2%-ий розчин AlCl3 у якості питної води і ту ж саму сумарну дозу радіації (12,9 мКл/кг) протягом 21 дня. Спричинені радіацією зміни оцінювали після досягнення даної дози. Щури контрольної групи отримували дистильовану питну воду.
Зовнішнє тотальне опромінення проводили на апараті РУМ-17 (потужність дози - 0,143 мА/кг, напруга - 200 кВ, струм - 15 мА, фільтр - 0,5 мм Сu, шкіряно-фокусна відстань - 50 см, тривалість сеансу - 1,6 хв., поле - 20 х 20 см2.
Концентрація Al в експерименті складала 400 мг/л. Допустима концентрація Al у питній воді - 50 мкг/л, LD50 для AlCl3 (перорально, щури) - 3450 мг/кг [144]. Вміст Al у водоймищах України складає від 0 до 242,2 мг/л [145].
За одиницу виміру опромінення (експозиційної дози) прийнятий кулон на 1 кг (Кл/кг) в одиницах СІ. LD50-30 опромінення для гризунів складає 0,23 Кл/кг [146].
2. Дослідження протекторного впливу пірацетаму при дії рентгенівського випромінювання.
Експериментальні тварини було розділено на 6 груп (n = 7-8): щури груп 1-3 отримували сумарну дозу радіації 12,9 мКл/кг протягом 7, 14 та 21 днів відповідно; тваринам груп 4-6 за годину до опромінення інтраперітонеально вводили пірацетам (0,2 г/кг маси тіла) протягом усього дослідження відповідно - на 7-й, 14-й та 21-й день; сумарна доза опромінення становила, як і в інших серіях дослідів, 12,9 мКл/кг. Режим та умови опромінення описано вище. Контрольній групі щурів вводили фізіологічний розчин у відповідному об'ємі.
3. Вивчення впливу вітаміну Е (?-токоферолу) на метаболізм білка гліальних ПФ за умов впливу Аl3+.
Піддослідні тварини були розділені на три групи (n = 7-8): 1 - щури, які отримували 0,2%-ий розчин AlCl3 у якості питної води; 2 - щури, які одержували ту ж кількість AlCl3 у питній воді та інтраперітонеально ?-токоферолу ацетат у маслиновій олії у розрахунку 10 мг/кг маси тіла; 3 -щури отримували ту ж саму дозу вітаміну Е інтраперитонеально. Контрольним тваринам внутрішньочеревно вводили маслинову олію у тому ж об'ємі. Ін'єкції проводилися п'ять разів на тиждень протягом 90 днів.
2.3. Схема одержання фракцій цитоскелетних білків
Головний мозок щурів виймали та розділяли на відділи (мозочок, великі півкулі, середній мозок і гіпокамп). Схема отримання фракцій, які містили білки ПФ головного мозку дослідних та контрольних щурів, наведена на рис. 2.1. Тканину мозку після відокремлення від оболонок і кровоносних судин гомогенізували у скляному гомогенізаторі з тефлоновим поршнем у 50 мМ трис-HCl буфері (рН 7,4) у співвідношенні тканина:буфер - 1:5.
Тканина мозку + буфер А (1:5)
Центрифугування, 30000 g, 60 хв.
S1¬ Р1
промивка осаду (Р1 ): центрифугування з буфером А
(1:2) 30000 g, 45 хв.
Р1 ( + буфер В)
ресуспендування
інкубація з буфером В 12 год. при t°= +4°С
центрифугування, 5000 об/хв, 60 хв.
S2 ¬ P2
Рис.2.1 Схема одержання білкових фракцій головного мозку щурів: S1 - фракція розчинних білків; S2 - сечовинна (філаментна) фракція білків; Р1 - осад після першого етапу центрифугування; P2 - осад після другого етапу центрифугування.
Трис-буферна система (буфер А) містила 2 мМ ЕДТО, 1 мМ 2-меркаптоетанолу, 0,1 мМ фенілметилсульфонілфториду (ФМСФ) та 5 мМ соєвого інгібітору трипсину. Всі маніпуляції проводили при температурі 4о С. Гомогенат центрифугували при 30000 g протягом 60 хв. Отриманий супернатант (S1) містив розчинні білки мозку. Осад (Р1) промивали після його ресуспендування у тому ж буфері та центрифугування при 30000 g протягом 45 хв. Після цього осад ресуспендували у буфері А, який додатково містив 4 М сечовини (буфер В), та інкубували 12 год. Подальше центрифугування проводили при 30000 g протягом 60 хв. Супернатант (S2) містив водонерозчинні філаментні білки.
2.4. Методи визначення загальної кількості білка
Шир