РОЗДІЛ 2
ЛІПОПОЛІСАХАРИДИ ГРАМНЕГАТИВНИХ БАКТЕРІЙ: ХІМІЧНА ІДЕНТИФІКАЦІЯ ТА БІОЛОГІЧНА АКТИВНІСТЬ
2.1. Топологія ЛПС в бактеріальній клітині
Клітинна оболонка грамнегативних бактерій за складом та молекулярною організацією являє собою комплексну структуру. Детальне вивчення морфологічних та біохімічних властивостей показало наявність у її складі трьох структурних шарів: цитоплазматичної мембрани, тонкого шару пептидоглігану та зовнішньої мембрани (рис.2.1).
Рис.2.1. Клітинна оболонка грамнегативних бактерій [39]
На сьогоднішній день склад і морфологія зовнішньої мембрани грамнегативних бактерій добре вивчені. Показано, що це двошарова асиметрична структура, основними компонентами якої є білки, ЛПС та фосфоліпіди [39]. Зовнішнішній шар зовнішньої мембрани на 59 % вкритий білками і на 41 - 75 % - ЛПС, а внутрішній - на 53 % фосфоліпідами та на 47 % - білками [40]. ЛПС є одним із основних структурних компонентів зовнішньої мембрани грамнегативних бактерій. Визначено, що він складає 3 % від загальної сухої бактеріальної маси таких типових лабораторних штамів як E. coli К-12 і більш ніж 10 % у диких штамів E. coli S-типу [41].
ЛПС не здатні утворювати комплексні сполуки з фосфоліпідами, оскільки локалізовані в різних ділянках зовнішньої мембрани клітинної оболонки, але утворюють комплекси з білками [40, 42, 43]. Так, ЛПС і один із білків зовнішньої мембрани E. coli утворюють частки з упорядкованою структурою у вигляді гексагональної градки, натомість, по одинці ні білок, ні ЛПС не здатні до утворення подібної конформації [44, 45]. Іншим важливим підтвердженням існування зв'язку між білком і ЛПС є той факт, що лише при наявності обох цих компонентів можуть проявлятись певні види функціональної активності. Так, рецепторна функція основних білків зовнішньої мембрани до ряду факторів і коліцину А може бути здійснена лише в присутності ЛПС, який, в свою чергу, лише в комплексі з білком здатний слугувати як рецептор фагів [45].
На сьогодні існує припущення, що білки зовнішньої мембрани характеризуються наявністю двох зон зв'язування з молекулою ЛПС. Одна з цих афінних ділянок взаємодіє з ліпідом А. Комплекс ліпід А - білок, виділений з ендотоксинів ряду грамнегативних бактерій, подібний за своїми властивостями до ліпополісахарид-білкового комплексу (ЛПБ-комплекс) і проявляє рецепторну активність до бактеріофагів. Інша афінна ділянка взємодіє із олігосахаридом кору. Для створення зв'язку в цьому випадку велике значення має довжина вуглеводного ланцюга. Так, лише при умові наявності повної структури кору спостерігається сильна взаємодія з утворенням ЛПБ-комплексу [46].
Як вже зазначалося, однією з особливостей зовнішньої мембрани грамнегативних бактерій є те, що молекули ЛПС розташовані виключно в зовнішній її частині, а гліцерофосфоліпіди - винятково у внутрішній. В той час коли гліцерофосфоліпідний шар є плинним при нормальних умовах культивування бактерій, проявляє схожу поведінку і ознаки з гліцерофосфоліпідним шаром цитоплазматичної мембрани, моношар ЛПС характеризується високовпорядкованою квазікристалічною структурою. Така впорядкованість обумовлена наявністю дивалентних катіонів, які слугують містками між молекулами ЛПС, а також нейтралізують сили відштовхування, що виникають між молекулами ЛПС та "кислими" молекулами білку. Показано, що видалення катіонів за допомогою обробки етилендиамінтетраацетатом (ЕДТА) призводить до вивільнення ЛПС і ЛПБ-комплексів, так як сили електростатичного відштовхування стають домінуючими над гідрофобними силами, які зв'язують ЛПС [40, 47, 48]. Ефект ригідності зовнішньої мемрани клітинної оболонки також, частково, обумовлений жорсткістю упаковки жирнокислотних залишків ліпіду А [49].
Тобто, ЛПС є одним із основних структурних компонентів зовнішньої мембрани клітинної оболонки грамнегативних бактерій, які приймають участь у забезпеченні її цілісності та стабільності. Як зовнішні компоненти клітини вони приймають участь у взаємодії мікроорганізмів з довкіллям. ЛПС являють собою основні термостабільні поверхневі антигени, виконують та обумовлюють ряд інших важливих функцій та біологічних активностей грамнегативних бактерій [47], які будуть розглянуті нижче.
2.2. Структура ЛПС грамнегативних бактерій
У 1840 році Jacob Henle висловив припущення, що причиною захворювання людини може бути: - "Жива і невидима субстанція, що здатна до росту і розмноження". Понад 25 років по тому Луї Пастер показав, що група захворювань, які ми на сьогодні відносимо до інфекційних, індукуються саме мікроорганізмами. У 1884 році Роберт Кох ідентифікував збудника холери. Невдовзі з'явились дані, які свідчили про білкову природу токсинів багатьох збудників інфекційних процесів. Незабаром Richard Pfeifer, зазначив, що холерні вібріони, окрім термолабільного токсину, продукують додатково, інший, відмінний токсин, який міцно асоційований з клітинною стінкою і відзначається температурною стабільністю, тобто має не білкову природу. В своїй публікації він зазначив, що: - "В молодій культурі Vibrio cholerae, вирощеній в аеробних умовах, міститься специфічна токсична субстанція, що проявляє надзвичайно сильний токсичний ефект. Індуктор цієї токсичної активності зв'язаний з клітиною і, ймовірно, є інтегрованим компонентом бактеріальної клітини. Клітина може бути вбита дією хлороформу, тимолу або висушуванням без будь-якої вловимої втрати токсичності" Для означення цієї субстанції Pfeifer вперше використав термін "ендотоксин" [49 - 51].
В 1932 році Andre Boivin і Lidia Mesrobeanu розробили метод екстракції ендотоксинів за допомогою трихлороцтової кислоти (ТХО). Отриманий ними макромолекулярний комплекс містив ліпід і полісахарид з невеликою кількістю білка. На основі встановленого складу вони запропонували означити цей комплекс як antigens glicido - lipidiques [49].
Пізніше, в 1951 році Otto Westphal спільно з Otto Luderitz розробили водно-фенольний метод екстракції ендотоксинів грамнегативних бактерій, який на сь