РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
2.1. Матеріали дослідження
Для вивчення видового складу ґрунтових мікроскопічних грибів різних промислових регіонів України влітку 2002 р. на глибинах 0 - 5 і 18 - 20 см було відібрано 50 зразків сучасних чорноземних ґрунтів. Зразки ґрунту відбирали на відстані 50 м від цехів заводів чорної металургії "Запоріжсталь" (м. Запоріжжя), заводу кольорових металів м. Артемівськ (Донецька обл.), ділянці покладів міді в хуторі Картамиш (Попаснянський район, Луганська обл.). Контролем слугували зразки ґрунту історичного заповідника "Мамай-гора" (с. Велика Знаменка, Запорізька обл.) і ботанічного заповідника "Михайлівська цілина" (с. Катеринівка, Лебединський район, Сумська обл.).
На глибині 2,5 м було відібрано 18 зразків каштанових ґрунтів на території заповідника "Ольвія" (с. Парутіно, Миколаївська обл.) безпосередньо у місцях стародавніх плавильних горнів та на відстані 25 м від них (контроль). Для відбору стародавніх ґрнутів здійснювали ґрунтовий розріз із застосуванням спеціально сконструйованого пробовідбірника, максимально дотримуючись умов стерильності. Вік цих ґрунтів становить понад 2500 років [62, 76].
Вище вказані зразки ґрунту були люб`язно надані нам к. геол.-мінерал. н., ст.н.с. Інституту геохімії, мінералогії і рудоутворення НАН України В.Й. Манічевим, за що ми йому щиро вдячні.
Для дослідження деструкції бетону мітоспоровими грибами з допомогою модифікованого нами методу агарових блоків використовували зразки бетону (марка 450), з якого на Вишгородському заводі ЗБК АТ тресту "Південатомспецбуд" виготовляють залізобетонні контейнери марки КЗНП-2,1, призначених для зберігання радіоактивних відходів. Для дослідження вилужування хімічних елементів з бетону мітоспоровими грибами в умовах глибинного культивування використовували подрібнений бетон з розміром частинок 1 - 2 мм.
Зразки бетону люб`язно надані нам н.с. Інституту геохімії навколишнього середовища НАН і МНС України В.М. Кадошніковим, за що ми йому щиро вдячні.
2.2. Культури мікроскопічних грибів, використані у роботі
У роботі використано 119 видів 52 родів (420 штамів) мікроскопічних грибів, які були виділені нами із забруднених іонами важких металів ґрунтів та для порівняння - ґрунтів заповідних територій.
Резистентність та хемотропічні реакції мікроскопічних грибів до іонів міді різної концентрації, що містились в агарових блоках, вивчали на 22 видах 12 родів (34 штами) мікроскопічних грибів: Alternaria alternata, Aspergillus niger, A. ochraceus, A. ustus, Cladosporium cladosporioides, Curvularia clavata, Fusarium oxysporum, F. sambucinum, F. sambucinum var. cоeruleum, Humicola fuscoatra, H. grisea, Oidiodendron cerealis, Paecilomyces lilacinus, P. marquandii, Penicillium funiculosum, P. thomii, P. velutinum, Stachybotrys chartarum, Trichoderma harzianum, T. viride, Ulocladium alternariae, U. botrytis. Критерієм, за яким відбирали штами, було місце виділення мікроскопічних грибів (забруднені важкими металами ґрунти та ґрунти заповідників) та наявність різних пігментів (темно- та світлозабарвлені види).
Швидкість радіального росту мікроміцетів до 6, 8 і 10 мМ Cu2+, що містились в агарових блоках, які були розміщені на відстані 2, 3, 4, 5 і 6 см від грибного інокулюму, вивчали на 5 видах 2 родів (6 штамів) мікроскопічних грибів: Fusarium oxysporum 137, F. oxysporum 385, Fusarium sambucinum 40, Fusarium sambucinum var. cоeruleum 123, Trichoderma harzianum 23, Trichoderma viride 614. Дані штами мали високу швидкість радіального росту, що дозволило їх обрати для дослідження відстані, на якій мікроскопічні гриби інгібують швидкість радіального росту у напрямку до іонів міді в агарових блоках.
Для дослідження сорбційної здатності мікроміцетів до іонів міді були відібрані 29 видів 16 родів (72 штамів) мікроскопічних грибів. Вибір штамів обумовлений тим, що переважна більшість з них траплялися у ґрунтах з високою частотою ( > 30 %). Темнозабарвлені види траплялися у ґрунтах з меншою частотою, але представляли значний інтерес, оскільки, за даними літератури, вони є активними біосорбентами іонів важких металів за рахунок пігменту меланіну, який, наприклад, у видів роду Cladosporium складає близько 30 % грибної біомаси [15, 32, 184, 198]. Крім того, об`єктами дослідження були музейні штами: Aureobasidium pullulans 184 і A. pullulans 2274, виділені із ґрунту на території Чорнобильської атомної електростанції (ЧАЕС) у 1986 р. та ґрунту Голосіївського лісу м. Києва у 1973 р. відповідно, а також Cladosporium cladosporioides 396, виділений із ризосфери на території Західної України у 1957 р.
Об`єктами дослідження деструкції бетону були 7 видів 4 родів (7 штамів) мітоспорових грибів: Aspergillus niger 42, A. flavipes 38, A. versicolor 26, A. repens 28, Paecilomyces lilacinus 20, Cladosporium сladosporioides 3 і Alternaria alternata 37. Висловлюємо глибоку вдячність н.с., к.б.н. Захарченко В.О., та пров. інженерам Артишковій Л.В. і Наконечній Л.Т. за допомогу в ідентифікації мікроскопічних грибів.
2.3. Культивування мікроскопічних грибів
Для виділення та ідентифікації мікроскопічних грибів використовували агаризовані поживні середовища: картопляно-глюкозне середовище (КГА), пивне сусло (сусло-агар, СА) та Чапека (ЧА):
- КГА: дистильована вода - 1 л, картопля - 500 г, NaCI - 5,0 г, глюкоза - 20 г; агар-агару - 20 г; рН - 7,0 -7,2.
- СА: пивне сусло, сахаристість 8° Б - 1 л, агар-агар - 20 г; рН - 7,0-7,2;
- ЧА: NaNО3 - 2,0 г; KH2PO4 - 1,0 г; MgSO4 - 0,5 г; KCI - 0,5 г; FeSO4 - 0,01 г; сахароза - 30,0 г; агар-агар - 20,0 г; дистильована вода - 1,0 л; рН - 5,0 - 5,2.
Для дослідження швидкості радіального росту мікроскопічних грибів використовували вище вказане агаризоване середовище ЧА та голодний агар (ГА): дистильована вода - 1 л, агар-агар - 20 г; рН - 7,0-7,2.
Для отримання біомаси з метою дослідження сорбційних властивостей мікроскопічних грибів використовув