РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ
2.1. Матеріали та реактиви
У роботі були використані такі реактиви: HEPES, АТФ, середовище RPMI 1640,
флюоресцентні Са2+-чутливі зонди індо-1AM та фура-2AM, розчинник для зондів
Pluronic F-127, тапсигаргін, циклоспорин А (Sigma, CША), EГТА (Serva, США),
рутенієвий червоний (Fluka, Швейцарія), радіоактивний ізотоп (45СаCl2 +
40CaCl2) (Amersham, Великобританія).
Решта реактивів (глюкоза, фосфат калію, дифеніламіновий реактив, хлорид
кальцію, диметилсульфоксид, дигітонін, лимоннокислий натрій, пероксид водню,
ембріональна теляча сироватка та інші) вітчизняного виробництва кваліфікації
“ч.д.а.”, “х.ч.” та “о.с.ч.”.
Для вивчення транспорту Са2+ були використані мембранні фільтри “Millipore”
(США) (діаметр пор – 0,45 нм).
2.2. Виділення тимоцитів щура
Досліди проводили на щурах лінії Вістар обох статей вагою 120 - 150 г, яких
утримували на стандартному раціоні. Після декапітації тварин проводили розтин
грудної порожнини, обережно, щоб не пошкодити кровоносні судини, вилучали тимус
та поміщали його у буфер А такого складу (мМ): Na2HPO4 - 3, KCl - 5, NaCl -
120, CaCl2 - 1, глюкоза - 10, Mg Cl2 - 1, NaHCO3 - 4, HEPES - 10, рН 7,4. Тимус
відділяли від сполучної тканини та кровоносних судин і перетирали через чотири
шари нейлонової сітки у буфері А. Загальний об’єм доводили до 10 мл. Отриману
суспензію клітин двічі відмивали (600 g, 10 хв) у тому ж буфері. Надосадову
рідину зливали, а осад ресуспендували до концентрації 2-5 x 108 кл/мл.
Кількість тимоцитів підраховували за допомогою світлового мікроскопу Biolam
„ЛОМО” Р12 у камері Горяєва з використанням 0,4 % розчину трипанового синього.
2.3. Умови опромінення та інкубації тимоцитів
Вихід тимоцитів у середньому складав 10 х 108 клітин/г тимусу. Інкубацію клітин
(2-4 х 106/мл) здійснювали у термостаті при 37оС у середовищі RPMI-1640 з
додаванням 10%-ої ембріональної телячої сироватки для збереження високої
буферної ємності середовища та стабілізації плазматичної мембрани клітин, що
дозволило підтримувати функціонально-метаболічний стан ізольованих клітин
протягом інкубації упродовж 3 год. По закінченню терміну інкубації клітини
осаджували (600 g, 10 хв) та ресуспендовували у буфері А у потрібному
співвідношенні.
Умови експерименту:
Як контроль використовували суспензію інтактних клітин у середовищі інкубації;
У середовище інкубації клітин додавали пероксид водню до кінцевої концентрації
0,1 мМ;
Перед інкубацією клітинну суспензію піддавали однократному рентгенівському
опроміненню у дозі 4,5 Гр.
Опромінення клітинної суспензії здійснювали на установці РУМ-17 за таких умов:
експозиційна доза - 11,61 х 10-2 Кл/кг (поглинута - 4,5 Гр), потужність дози -
0,24 Гр/хв, фільтри 0,5мм (Сu + Аl), напруга 200 кВ, сила струму 10 мА, фокусна
відстань - 50 см.
2.4. Оцінка фрагментації ДНК у клітинах
Кількісне визначення високомолекулярної та фрагментованої ДНК проводили за
методом Бартона [46]. Клітинну суспензію тимоцитів (106 кл/мл) тричі відмивали
розчином Хенксу від середовища RPMI-1640 (1000g, 5 хв). До отриманого осаду
додавали 400 мкл охолодженого буферу для лізісу клітин, що містив 10 мМ
трис-HCl (рН 7,4), 10 мМ ЕДТА, 0,5 % тритон Х-100. Проби витримували на холоду
15 хв, після чого центрифугували (15000 g, 20 хв) для розділення інтактного
хроматину (осад) та фрагментів ДНК - полідезоксирибонуклеотидів (ПДН)
(супернатант). До надосадової рідини додавали 0,1 мл 25% HClO4. Проби залишали
на холоду на 1 год для екстрагування полідезоксирибонуклеотидів, після чого
інкубували на водяній бані при 70о С 15 хв та центрифугували (2000g, 10 хв) для
осадження білків. До супернатанту додавали 1 мл дифеніламінового реактиву (1,5
% дифеніламін, 100 % оцтова кислота, 1,5 % конц. H2SO4, 1,6 % водний
ацетальдегід). Проби витримували упродовж 20 год у термостаті при 30оС, після
чого вимірювали поглинання при 600 нм на спектрофотометрі СФ-46. Вміст ПДН
виражали у відсотках від загальної кількості ДНК у клітинах.
Визначення [Ca2+]i за допомогою флюоресцентних зондів
Концентрацію вільного цитозольного Са2+ вимірювали за допомогою зондів індо-1
та фура-2. До суспензії клітин ( 3 Ч 107/ мл) у буфері А додавали
ацетоксиметиловий ефір індо-1 або фура-2 (5 мкмоль/л) та Pluronic F-127 (0,05%)
для полегшення розчинення зонду у гідрофільному середовищі. Клітини
навантажували зондами протягом 40 хв при 250 С, а потім відмивали від надлишку
зондів двократним центрифугуванням (600 g, 10 хв) з наступним ресуспендуванням
у буфері А.
Експерименти проводили за двома схемами:
1) З використанням індо-1AM. Тимоцити (2-4 Ч 106 клітин / мл середовища
RPMI-1640) піддавали дії досліджуваних апоптогенних чинників, потім інкубували
у термостаті за 370С упродовж визначеного терміну. Після інкубації клітини
відмивали від середовища (600 g, 7 хв) та переводили в буфер А (3 Ч 107 клітин
/ мл) Тимоцити навантажували зондом, як описано вище. Реєстрацію спектру
флюоресценції суспензії (2,5 Ч 106 клітин / мл) проводили за 250 С.
2) З використанням фура-2AM. Тимоцити у буфері А (3 Ч 107 клітин / мл),
навантажували зондом, як описано вище. Інкубацію навантажених Fura-2AM клітин
(2,5 Ч 106 клітин / мл) проводили безпосередньо в кюветі спектрофлюориметра за
250 С з додаванням ефекторів та реєстрацією спектру флюоресценції у динаміці
упродовж визначеного терміну.
Спектр флуоресценції індо-1 (F) реєстрували на спектрофотометрі СДЛ-2 (ЛОМО,
Росія), довжина хвилі збудження (лзбудж.) - 350 нм, довжини хвиль
випромінювання (лвипр.) – 410 та 495 нм. Спектр флуоресценції фура-2
реєстрували на спектрофотометрі Shimadzu RF-510 (Японія), лзбудж. = 330 та 3
- Київ+380960830922