розділ 2. матеріали та методи дослідження
Загальний об’єм досліджень, проведений при виконанні дисертації, представлений
в таблиці 2.1.
Таблиця 2.1
Об’єм виконаних досліджень
Дослідження
Кількість
Експериментальні дослідження
90 щурів
Хворі, які отримували хіміопроменеву терапію без опромінення шляхів
лімфовідтоку (1995-2000 рр.)
113 хворих
Хворі, які отримували хіміопроменеву терапію з опроміненням зон реґіонарного
метастазування (2001-2004 рр.)
43 хворих
Хворі, які отримували хіміопроменеву терапію з опроміненням зон реґіонарного
метастазування на фоні мелатоніну та вітамінів А і Е (2001-2004 рр.)
60 хворих
Хворі, оперовані у 1995-2000 рр. (контрольна група)
290 хворих
2.1. Експериментальні дослідження
Досліди проведені на 90 дорослих безпородних білих щурах-самцях – розведення
віварію Буковинського державного медичного університету, масою 190-210 г.
Тварин утримували у віварії при температурі 20±1°С (14 годин світла, 10 годин
темряви) на стандартній дієті з вільним доступом до води. Тварин було поділено
на 5 груп.
Тварини першої групи (18 щурів) були інтактними і служили контролем.
До другої групи увійшли 15 щурів, яким перорально через спеціальний зонд
вводили мелатонін (суспензію препарату „Віта-мелатонін” фірми „Дарниця”) в дозі
10 мг/кг маси тіла тварини один раз на добу (всього 5 разів) – тварин забивали
після закінчення введення мелатоніну (на 5 добу).
У щурів третьої групи (21 тварина) опромінювали ділянку епігастрію полем 4х4
см, яке захоплювало весь шлунок, печінку, селезінку, підшлункову залозу, нирки,
разовою вогнищевою дозою 5 Гр щоденно протягом 4 днів до сумарної вогнищевої
дози 20 Гр, перорально вводили фізіологічний розчин із розрахунку 1 мл / 100 г
маси тіла тварини. Дистанційне гамма-опромінення епігастрію проводили чотири
рази на апараті “АГАТ Р1У” з енергією випромінювання 1,25 МеВ (радіоактивний
ізотоп 60Со). Відстань від джерела до поверхні тіла тварин складала 75 см. Для
опромінення щурів іммобілізували у спеціальних пластикових пеналах; екранування
здійснювали свинцевими пластинами, залишивши відкритою тільки ділянку
епігастрію 4х4 см. Щурів цієї групи забивали після закінчення опромінення,
через 7 і через 14 днів після закінчення опромінення.
Четвертій групі щурів (22 тварини) на фоні опромінення перорально вводили
мелатонін у дозі 10 мг/кг [87,277]. Тваринам вводили мелатонін за день до
початку опромінення та протягом усього його курсу. 8 щурів забивали після
закінчення курсу опромінення. 7 тварин отримували мелатонін ще 7 днів після
закінчення опромінення, після чого їх забивали. 7 щурам вводили мелатонін
протягом 14 днів після курсу опромінення і після цього проводили їх забій.
Щури п’ятої групи (14 тварин) протягом курсу опромінення отримували перорально
вітамін А у дозі 10000 МО/кг маси тіла тварини, вітамін Е у дозі 100 мг/кг маси
тіла та мелатонін у дозі 10 мг/кг маси тіла. Мелатонін і вітаміни А і Е вводили
перорально через зонд напередодні променевої терапії і щоденно за 1 год до
сеансу опромінення протягом всього його курсу. 6 щурів отримували мелатонін та
вітаміни ще протягом 7 днів після закінчення опромінення, після чого їх
забивали. 8 щурам вводили мелатонін і вітаміни А і Е протягом 14 днів після
закінчення опромінення і після цього проводили їх забій.
Евтаназію здійснювали під легким ефірним наркозом, забирали печінку, шлунок,
нирку, селезінку і цільну кров. Із печінки, шлунка, нирок та селезінки готовили
5%-ний гомогенат на 50 мМ трис-HCl буфері (рН 7,4), центрифугували і
супернатант використовували для аналізу показників про- та антиоксидантної
системи, та 10%-ний гомогенат на боратному буфері (рН 9,0), який центрифугували
і супернатант використовували для аналізу показників протеолітичної, зокрема
фібринолітичної активності плазми крові та органів.
Еритроцити отримували із цільної крові, стабілізованої розчином гепарину (25 ОД
на 1 мл), шляхом центрифугування її впродовж 30 хв при 3000 об/хв. Їх двічі
відмивали охолодженим фізіологічним розчином натрію хлориду, осаджували і
гемолізували рівним об’ємом дистильованої води.
У цільній крові, плазмі, еритроцитах та супернатантах гомогенату печінки
визначали вміст малонового діальдегіду (МДА) за реакцією з ТБК, реагуючи з якою
МДА утворює триметиновий комплекс, що флуоресціює [68]; окисномодифікованих
білків за реакцією окислених амінокислотних залишків білків з
2,4-динітрофенілгідразином з утворенням забарвлених продуктів [49];
відновленого глутатіону (ВГ) за реакцією окислення ВГ йодноватокислим калієм з
виділенням вільного йоду, що дає з розчином крохмалю блакитне забарвлення [51];
активність супероксиддисмутази (СОД) за зниженням рівня відновленого
нітросинього тетразолію при реакції з супероксидними аніонами [75];
глюкозо-6-фосфатдегідрогенази (Г-6-ФДГ) за методом Захарьина Ю.Л. [31];
глутатіонредуктази (ГР) за Beutler [109] та вміст церулоплазміну (ЦП) за
окисленням п-фенілендіаміну [37]. У супернатантах гомогенату шлунка визначали
вміст МДА [68], ОМБ [49], ВГ [51], активність К за реакцією розщеплення
стійкого забарвленого комплексу, що утворюється при взаємодії пероксиду водню з
солями молібдену [40], глюкозо-6-фосфатдегідрогенази (Г-6-ФДГ) [31], ГР [109].
Концентрацію білка визначали за Lowry та співавт. [196].
Стан фібринолітичної активності плазми та супернатантів гомогенатів шлунка,
печінки, селезінки, нирок визначали на основі реакції з азофібрином. Принцип
методу полягав у тому, що при інкубації азофібрину зі стандартною кількістю
плазміногену в присутності активаторів фібринолізу, що містяться в плазмі чи
тканині, утворюється плазмін, активність якого оцінюється за ступенем
- Київ+380960830922