ГЕНЕТИЧНИЙ КОМБІНОВАНИЙ СКРИНІНГ ПЕРШОГО ТРИМЕСТРУ ВАГІТНОСТІ ЯК РАННІЙ МЕТОД ПРЕНАТАЛЬНОЇ ДІАГНОСТИКИ

<p>РОЗДІЛ 2<br /> МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ<br /> 2.1. Характеристика дослідженої групи вагітних. <br />Матеріалом для дослідження були результати комбінованого генетичного скринінгу<br />першого триместру вагітності, проведеного в Інституті генетики репродукції в<br />період з жовтня 2001 по травень 2003 року. Всього генетичний скринінг було<br />здійснено у 2560 вагітних жінок. До групи жінок, які були включені у<br />досліджувану групу після відбору з метою добитися необхідної статистичної<br />однорідності вибірки входило 2248 жінок з прогресуючою вагітністю. Група<br />високого комбінованого ризику щодо хромосомної патології плода нараховувала 185<br />вагітних. <br />Вік жінок коливався від 14 до 45 років і в середньому складав 32,2 +4,1 року.<br />Для подальшого дослідження всі вагітні були розподілені на 10 вікових груп з<br />інтервалом у три роки. <br />Комплексна пренатальна діагностика включала ультразвукові дослідження, скринінг<br />маркерів материнської сироватки, інвазивні маніпуляції та цитогенетичні<br />дослідження плоду. <br /> 2.2. Біохімічні маркери сироватки крові жінок.<br />У програмі біохімічного скринінгу I триместру вагітності використовували в<br />якості маркерів плацентарний білок РАРР-А, АФП та вільну субодиницю<br />хоріонічного гонадотропіну (b-ХГ). <br />Показники біохімічних маркерів конвертовані в МоМ по генерованих медіанах після<br />вивчення цих маркерів у 9200 вагітних, які пройшли скринінгове дослідження у<br />Чиказькому Інституті репродуктивної генетики протягом 1998-2000 років, що<br />корелює з даними аналогічної програми в Білоруському республіканському<br />медико-генетичному центрі. Вагітності закінчилися терміновими пологами.<br />Хромосомні порушення у новонароджених, які в антенатальному періоді не були<br />відненсені до групи високого комбінованого ризику, не були виявлені [183]. <br />Рівні вказаних маркерів у сироватці крові вивчали флуоресцентним методом за<br />допомогою стандартних та програмно адаптованих реагентів DELFІAR hAFP/FreehCG<br />на флюороімунному аналізаторі фірми “WALLAC OY” (Фінляндія), розробленого на<br />техніці сендвіча, у якого АФП представлений моноклональними антитілами<br />(отриманими у мишей) спрямованими реактогенно проти двох окремих антигенних -<br />детермінант, та вільний ХГ виявлений у такий же спосіб двома моноклональними<br />антитілами. Стандарти, контроль та зразки крові вагітних, які містять АФП з ХГ<br />реагують зі специфічними моноклональними антитілами [47,73,81,85 ]. <br />Одночасно, АФП реагує з позначеним європієм моноклональним антитіломю Позначені<br />мітками антитіла спрямовані проти різних антигенних детермінант, чим це їх<br />відрізняє від імобілізованих антитіл. <br />Рівні free-hCGb та РАРР-А в сироватці крові також вивчали та кількісно<br />аналізували флуоресцентним методом за допомогою стандартних та програмно<br />адаптованих реагентів DELFІAR FreehCGb та DELFІАR РАРР-А. <br />Гормон РАРР-А на початковому етаі реагує з позначеним європієм моноклональним<br />антитілом, а b-hCG реагує відповідно з позначеним самарієм моноклональними<br />антитілом. Ідентичність та однонаправленність реакцій для кількісного аналізу<br />гормонів b-ХГ, РАРР-А та АФП, за винятком міткових елементів, дала можливість<br />проводити дослідження синхронно та одним комп’ютерним пакетом. Таким же чином<br />розроблена технологія і для РАРР-А. Достатньо тільки однієї інкубації. <br /> Доаналітична стадія.<br />Забір крові проводили через венепункцію. Відокремлення сироватки здійснювали у<br />маніпуляційному кабінеті. Дослідження проводили в термін до трьох діб.<br />Зберігали зразки сироватки крові в цьому випадку про температурі +2 - +8°C.<br />Відокремлювали фракції сироватки від цільної крові в короткий термін часу (до 3<br />годин). При зберіганні зразків сироватки більше 2 діб температура була -20° C.<br />Повторного заморожування й розморожування уникали. <br /> Техніка виконання біохімічних досліджень.<br />Виконання кожного гормонального визначення проведено у подвійному екземплярі<br />для обох стандартів та досліджуваного зразка. Всі реактиви та зразки були<br />принесені до кімнати з температурою +20 - +25°C. <br />Схема проведення дослідження або лабораторного етапу приведено на схемі-рисунку<br />2.1. <br /> Схема першого етапу<br />Відтворений стандарт<br />1.1 мл дистильованої води, 30хв.<br />Доведення до визначених концентрацій<br />(див. табл.)<br /> стріп<br />Концентрація розведення<br />Кількість буферу мл.<br /> hCG<br />hAFP<br />30<br />30<br />60<br />60<br />90<br />90<br />120<br />120<br />12<br />150<br />150<br />15<br />180<br />180<br /> 18<br />Добавлення розчинника до зразків та контролю<br /> 200 mL+ 25mL <br /> Інкубація, <br />промивка у вошері та посилення<br /> <br />2 години 30 хвилин у режимі повільного<br />шейкінг програмний вошер 67(х6) та підсилюючий шейкінг 5 хвилин 200uл<br /> Підрахунок<br />Вібір hAFP/Free hCG MultiCalc program (перевірка результатних концентрацій) <br /> Схема другого етапу<br />Відтворення стандарту<br />1.1 мл дистильованої води 30 хв. <br />Розбавлення ділюантом DELFIA<br />1 :5<br />50 mL + 200 mL<br />Поступове доведення до міткових концентрацій<br />(див. табл.)<br /> стріп<br />Концентрації послідовного розведення суміші антитіл та калібрувального розчину <br />кількість буферу мл.<br />120<br />1,5<br />240<br />3,0<br />360<br />4,5<br />480<br />6,0<br />600<br />7,5<br />720<br />9,0<br />Добавлення розчинника до<br />100mL<br /> Інкубація<br />30 хвилин у режимі повільного шейкінгу<br /> Вошінг<br />x2<br />Добавлення калібрувального розчину<br />100mL<br />Добавлення стандарту та розчинених зразків<br />50mL<br /> Інкубація, промивка у вошері та посилення<br />2 години у режимі повільного шейкінгу <br />підрахунок<br /> «KIT 98»<br />Вибір РАРР-А MultiCalc program (перевірка результатних концентрацій<br />Рис. 2.1. Узагальнююча схема-прото</p>