РАЗДЕЛ 2
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
2.1. Ботаническая характеристика Arnica chamissonis Less. ssp. foliosa (Nutt.) Maguire
В качестве исходного материала для клонального микроразмножения растений A. foliosa служили семена, любезно предоставленные научным сотрудником отдела медицинской ботаники Тернопольской государственной медицинской академии С. М. Марчишин.
A. foliosa (арника облиственная, сем. Asteraceae) - интродуцент, родина которого Северная Америка. По поводу систематического положения A. foliosa нет единого мнения. Некоторые авторы [6, 7] считают его подвидом Arnica chamissonis Less, другие [5] относят A. chamissonis и A. foliosa к отдельным видам.
Это травянистое многолетнее растение, высотой 60-70 см с многочисленными цветочными корзинками. Стеблевые листья широколанцетные, сидячие, супротивно расположенные по всему стеблю. Стебель прямой, опушенный, с розеткой прикорневых супротивных, короткочерешковых, яйцевидных листьев. Корневище с придаточными корнями. Цветки оранжево-желтые, собраны в крупные корзинки (3-5 см в диаметре), расположенные по одной на верхушке стебля. Краевые цветки - язычковые, женские, внутренние - трубчатые, обоеполые. Цветет в июне-августе. Плод - семянка, цилиндрическая, заостренная, с хохолком. Абсолютный вес семян 0,6 г. Один литр семян в среднем весит 200 г. Всхожесть - 15-20%. Семена не нуждаются в стратификации, прорастают в любое время. Цветет и обильно плодоносит на втором году жизни. На первом году жизни образует лишь приподнятую розетку с 8-10 листьями. Цветоносных стеблей на первом году вегетации не образуется. Сырье - цветочные корзинки (Flores Arnicae) - собирают в период полного развития женских язычковых цветков и используют в медицинской практике в качестве противовоспалительного и кровоостанавливающего средства [8,38,39]. Сбор цветков начинается в июне-июле и продолжается до начала октября. Урожай воздушно-сухих цветков при интенсивной культуре превышает 350 кг/га [5,9]. Выход основного действующего лекарственного вещества - арнифолина из листьев составляет 0,1%, из цветков - 0,2 % [39].
2.2. Методика клонального микроразмножения А. foliosa
Все работы по высадке семян, выделению и пересадке эксплантов из донорных растений, выращенных из семян in vitro, проводились в асептических условиях в ламинарных боксах типа Gelaire-100, оборудованных пылезащитными камерами со стерильной подачей воздуха и ультрафиолетовым облучением типа УТД-2. Питательные среды стерилизовали в автоклаве ГК-100 при 0,7 атм. в течение 20 мин. Лабораторную посуду стерилизовали сухим жаром при 1600С 45 мин. Инструменты стерилизовали спиртом с последующим обжиганием в пламени горелки. Рабочие поверхности и руки протирали спиртом. Для исследований семена замачивали на ночь в насыщенном растворе КмnО4. Затем поверхностно стерилизовали 15%-ным раствором перекиси водорода в течение 15 мин., с последующим двухразовым промыванием стерильной дистиллированной водой. Семена высаживали, немного заглубляя, на поверхность питательной среды МС [76] следующего состав в мг/л: NH4NO3 - 1650; KNO3 - 1900; CaCl2 ? 2H2O - 440; MgSO4 ? 7H2O - 370; KH2PO - 170; KI - 0.83; H3BO3 - 6.2; MnSO4 ? 4H2O - 22.3; ZnSO4 ? 7H2O - 8.6; Na2MoO4 ? 2H2O - 0.25; CuSO4 ? 5H2O - 0.025; CaCl2 ? 6H2O - 0.025; FeSO4 ? 7H2O 27.9; Na-EDTA - 37.3; мезо-инозит - 100; глицин - 2; никотиновая кислота - 1; пиридоксин - 1; тиамин - 0,4; сахароза - 30 г/л, агар-агар "Difco" - 8 г/л. рН среды 5,6 - 5,8.
Пробирки с семенами помещали в термостат при температуре 22-240С, где они на третьи сутки в темноте начинали прорастать. Проростки культивировали на этой же среде 30 суток на свету. Культивирование проростков, эксплантов и регенерантов проводили при интенсивности освещения 2000 лк, температуре 20-220С и 16-часовом фотопериоде. Полученные ювенильные растения служили источниками эксплантов для последующего размножения in vitro. Листья донорных растений удаляли, стебель разделяли на сегменты размером 0,5-0,7 см, содержащие узлы или верхушку, сегменты помещали на различные варианты питательных сред на основе МС для регенерации микропобегов. Через 30 суток культивирования экспланты регенерировали пучки микропобегов. Пучки разделяли и микропобеги высаживали на модифицированную нами питательную среду МС для укоренения, где через 30 суток регенеранты укоренялись. Для культивирования стеблевых эксплантов использовали биотехнологические стаканы диаметром 30 мм, для укоренения микропобегов - конические колбы объемом 200 мл. Полученные растеньица с хорошо развитой корневой системой вынимали из колб, корни отмывали от агара и пересаживали в теплицу в субстрат из торфа и перлита (1:1) для адаптации к условиям in vivo. В теплице поддерживали стабильные условия: температура 20-24 0С, освещенность 8-10 тысяч лк, 16-часовой фотопериод. Первые 14 суток ящики с растениями обильно поливали и покрывали полиэтиленовой пленкой для создания повышенной влажности. Через 7 суток пленку точечно перфорировали, еще через 7 суток - снимали. После этих процедур растения-регенеранты пересаживали в почву на опытный участок, где они на второй год цвели и образовывали семена.
2.3. Метод планирования эксперимента по оптимизации состава питательной среды для культивирования эксплантов А. foliosa
Для оптимизации состава питательной среды использовали метод, предложенный В. П. Малышевым [104], позволяющий провести оптимизацию по многим компонентам за короткий период времени при небольшом количестве опытов. В качестве основы для оптимизации была выбрана пропись питательной среды МС [76]. Физиологически активные вещества - БАП, ИУК, а также NH4NO3, сахарозу, витамины, мезо-инозит вводили в питательную среду согласно матрице усеченного плана 6-факторного эксперимента, составленной нами по методу автора [104]. Уровни варьирования факторов (концентраций биологически активных веществ, минеральных солей и сахарозы) были выбраны нами. Эксперимент представлен 25 вариантами сред, по