РОЗДІЛ 2
ВЛАСНІ ДОСЛІДЖЕННЯ
2.1 МАТЕРІАЛИ і МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
Роботу виконано в лабораторії вивчення хвороб рогатої худоби ННЦ "Інститут експериментальної і клінічної ветеринарної медицини" УААН і Сумському національному аграрному університеті впродовж 1985 - 2005 рр. Об'єктами досліджень були велика і дрібна рогата худоба, свині, коні, що утримувалися в господарствах різної форми власності України, м'ясоїдні (собаки, коти), які належали власникам з міст Суми, Одеса і Київ, а також лабораторні тварини.
З метою вивчення частоти виділення ієрсиній, бактеріологічному дослідженню були піддані 272 матеріали. Матеріалом слугували органи загиблих і вимушено забитих тварин, абортовані плоди, вагінальний слиз (тампони) корів з дисфункцією відтворення, глотковий слиз (тампони), сперма биків-плідників, фекалії.
Виділення ієрсиній здійснювали з використанням методу "холодового збагачення" в фосфатно-буферному розчині (рН 7,2-7,4) досліджуваного матеріалу, який відбирали в стерильні флакони. Органи і тканини попередньо розтирали в ступці, додаючи фосфатно-буферний розчин в співвідношенні 1:5, закривали гумовими пробками і розміщували в холодильнику при +4?С для накопичення ієрсиній.
Накопичення ієрсиній здійснювали протягом 15 діб з періодичними висівами (3-4 рази) на середовище Ендо. Попередньо матеріал обробляли 0,5%-им розчином їдкого калію на 0,5%-му розчині натрію хлориду. Лужну обробку проводили в лунках полістеролових пластинок, оброблених 70? етиловим спиртом. В лунку вносили 0,2 мл 0,5%-го розчину їдкого калію і за допомогою пастерівської піпетки додавали краплину досліджуваного матеріалу. Суміш витримували протягом 2-3 хвилин при кімнатній температурі (18-20?С) і висівали бактеріологічною петлею на чашки Петрі з агаром Ендо. Засів проводили штрихом ї 1-2 відривами петлі. Посіви інкубували при 25?С. З чашок знімали 3-5 лактозонегативних колоній, дрібних, прозорих, з голубуватим відтінком через 18-24 години інкубування і колонії середніх розмірів з рожево-червоним центром і голубувато-сірою обводкою - через 36-48 годин. Полістеролову пластинку після закінчення роботи знезаражували 3%-им розчином їдкого калію протягом 30 хвилин. Як контроль використовували референтні штами Yersinia enterocolitica, що отримали в Українському інституті удосконалення лікарів і референтні штами Yersinia enterocolitica, Yersinia intermedia, Yersinia frederiksenii, Yersinia kristensenii, отримані в лабораторії пошукових досліджень Всеросійського НДІ епідеміології МОЗ Росії.
З метою ретроспективного вивчення розповсюдженості ієрсиніозної інфекції у сільськогосподарських і свійських тварин було досліджено 4819 сироватки крові тварин різних видів і вікових груп. Досліджувані сироватки не інактивували. Для розведення сироваток і антигенів використовували ізотонічний розчин кухонної солі з рН 7,2-7,4. Дослідження проводили за загальноприйнятою методикою в лінійній реакції Райта. Як антиген, використовували виготовлені нами формолантигени з референтних штамів Yersinia enterocolitica серотипів 03, 06.30, 09. Підставою для вибору серотипів ієрсиній були повідомлення Г.В.Ющенко з співавт. (1982), Є.Н.Колос з співавт. (1985) про циркуляцію певних серотипів Yersinia enterocolitica на території колишнього СРСР і повідомлень Г.С.Андрєєвої з співав. (1985) в Україні.
Антигени виготовляли за способом запропонованим В.І.Дунаєвим (1985). Культури ієрсиній попередньо вирощували на 0,5%-му агарі Хотінгера і протягом тижня щоденно пересівали для збільшення кількості рухомих форм.
Для накопичення бактеріальної маси використовували агар Хотінгера з додаванням 1%-ту глюкози і 0,2%-ту дріжджового екстракту (за В.І.Дунаєвим, 1986). Дане середовище заливали в пласкі колби по 250 мл і засівали культурами референтних штамів ієрсиній. Посіви вирощували протягом 36 годин при 25?С.
Бактерійну масу змивали забуференим ізотонічним розчином кухонної солі з рН 7,4. Інактивування бактерій проводили додаванням до суспензії при легкому перемішуванні формаліну, до кінцевої концентрації 1%, і витримували при 37?С протягом 1 доби. Повноту знезараження антигенів контролювали висівами на МПБ і МПА. Для прискореної РА з референтних штамів Yersinia enterocolitica серотипів 03, 06.30 і 09 окремо виготовляли забарвлені антигени. В звичайний антиген додавали до 12% кухонної солі і генціанвіолету з розрахунку 1:50000. Суміш ретельно перемішували і залишали в термостаті при 25?С на 6 діб. Зберігали антигени в умовах холодильника при +4?С. Антигени перевіряли на активність в РА з гіперімунними кролячими ієрсиніозними сироватками, на специфічність - з виготовленими біофабрично позитивними бруцельозною; сальмонельозною полівалентною аглютинуючою; аглютинуючою адсорбованою сироваткою Proteus полівалентною сухою кролячою; колі "О" аглютинуючою полівалентною "1", "2", "3", "4" і негативною кролячою сироваткою. Далі антигени фасували по 10 мл в "пеніцилінові" флакони, етикетували з вказуванням серії і дати виготовлення препарату. Густота антигену відповідала за оптичною щільністю 20 мільярдному бактеріальному стандарту.
В реакції використовували антиген в кінцевій концентрації бактерій 109 м.к. в 1мл. РА ставили в пробірках або полістеролових пластинках в об'ємі 1 мл. Витримували в термостаті при 37?С 16-18 годин і потім двічі проводили облік реакції через 6 і 24 години витримки пробірок при кімнатній температурі. Оцінку реакції проводили візуально і виражали в хрестах за 4-бальною системою:
1) різко позитивна реакція /++++/ - чітка аглютинація з наявністю пластівців в прозорій рідині;
2) позитивна реакція /+++/ - чітка аглютинація, але пластівці менш великі, що містяться в дещо опалісційованій рідині;
3) позитивна реакція /++/ - наявність аглютинації, але фон мутнуватий;
4) негативна реакція /-/ - рідина залишається після інкубації рівномірно мутною.
За мінімальний діагностичний титр приймали титр антитіл 1:200.
РА, РЗК з єдиним бруцельозним антигеном проводили згідно загальноприйнятій методиці.
Для постановки РНГА використовували
- Київ+380960830922