Вы здесь

Метаботропна регуляція синаптичного пуринергічного гальмування у вісцеральних гладеньких м'язах

Автор: 
Філіппов Ігор Борисович
Тип работы: 
Дис. канд. наук
Год: 
2008
Артикул:
0408U000785
99 грн
(320 руб)
Добавить в корзину

Содержимое

РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ
2.1. Виділення та підготовка препаратів.
В дослідах використовувались морські свинки невеликих розмірів (вагою порядку
250 - 300 г) незалежно від статі. Тварин наркотизували медичним ефіром і
умертвляли за допомогою декапітації та обезкровлення, і після цього розкривали
черево. Об’єктом дослідження були поздовжні (taenia coli) та кільцеві (cacum)
м’язи сліпої кишки, кільцеві м’язи дистального відділу товстого кишечника
(colon), а також гладенькі м’язи фундального відділу шлунка. Після очищення,
видалених ділянок шлунка і кишечника, від слизового і підслизового шару, в
розчині Кребса під бінокуляром нарізали м’язові смужки поздовжнього та
кільцевого шарів довжиною 0,7 – 1,2 см, шириною 0,2 – 0,3 см. Потім після
закріплення шовкової лігатури з обох кінців м’язових смужок їх поміщали у
свіжий розчин Кребса, де вони втримувалися до початку експерименту протягом 2
годин.
2.2. Реєстрація електричної та скоротливої активності гладеньких м’язів.
В якості основного методу досліджень використовували модифіковану методику
одинарного сахарозного містка [150], яка дозволяє одночасно відводити
електричну та реєструвати скоротливу активність гладеньких м’язів і адекватно
подразнювати м’язові смужки. Перевагою цього методу у порівнянні з методом
подвійних сахарозних містків полягає у можливості реєстрації синаптичних
потенціалів на подразнення інтрамуральної нервової системи інтестинальних
гладеньких м’язів електричним струмом. В умовах подвійних сахарозних містків
подразнення останніх неефективне із причини, що волокна, які знаходяться у
ізотонічному розчині сахарози, нездатні до збудження з причини відсутності
іонів Na+ в оточуючому середовищі. Концентрація цих катіонів поступово починає
збільшуватись у напрямку від межі сахарозних містків до центру тестової
ділянки. В наслідок малої величини l подразнюючий струм різко зменшується по
довжині нервових волокон. У результаті, в тому місці, де нервові волокна
відновлюють свою збудливість, щільність подразнюючого струму буде недостатньою
для їх подразнення. Метод модифікованого сахарозного містка не передбачає
використання сахарозної ізоляції між подразнюючими електродами і тим самим
немає вказаного недоліку. Треба зауважити, що у деякому відношенні метод
сахарозного містка зручніше методу внутрішньоклітинного відведення. Він
дозволяє досліджувати зміну синаптичної передачі протягом тривалого часу, тоді
як при внутрішньоклітинному відведенні від гладеньких м’язів цей час, звичайно,
не перевищує декількох хвилин, оскільки через відносно невеликі розміри ГМК
пошкодження їх мікроелектродом позначається дуже швидко.
Схематичне зображення експериментальної камери, яку використовували в наших
дослідах, показано на рис. 2.1. Вона розділена сахарозним проміжком на три
ділянки: тестуючи ділянку (3), сахарозну (2) та ділянку з непроточним
ізотонічним розчином КСІ (1). Розчин Кребса, раніше ніж потрапити в тестуючу
ділянку, проходить в поліетиленовій трубці через резервуар (4), заповнений
дистильованою водою заданої температури, яка підтримується за допомогою
ультратермостата U-10. Температура розчину в тест-ділянці вимірювалася
термістором (5). Перед тим, як помістити м’язову смужку в експериментальну
камеру один її кінець затягувався в Г-подібну поліетиленову трубку, діаметр
якої підбирався відповідно до товщини м’язової смужки. Лігатуру, яка
знаходилася на кінці смужки, закріпляли в верхньому усті цієї трубки. Після
цього м’язову смужку з трубкою переносили (6 і 7) до тест-ділянки камери.
Вільний кінець м’язової смужки, протягнув через сахарозний проміжок, закріпляли
в ділянці 1. Нитку, закріплену на вигині поліетиленової трубки, з’єднували з
важелем ємнісного датчика (6) і пристроєм для дозованого розтягнення м’язових
смужок (див. рис. 2.1). Довжина тієї частини м’язової смужки, яка знаходилася в
тест-ділянці (між сахарозним проміжком і поліетиленовою трубкою) складала 0,2 –
0,4 см. В тестуючій ділянці камери м’язова смужка обмивалася проточним розчином
Кребса, температура якого підтримувалася на рівні 36,5±0,5 °С. Заміну
обмиваючого розчину Кребса на тестуючий розчин робили за допомогою спеціального
багатоходового крану. Об’єм рідини в тестуючій ділянці камери при стаціонарному
протоці складав приблизно 0, 5 мл. Швидкість протоку, як правило, складала
приблизно 1 – 2 мл/хв, у випадку необхідності зміни розчину швидкість протоку
збільшували до 3- 5 мл/хв. Швидкість протоку сахарози через сахарозний проміжок
регулювався таким чином, щоб не перевищував 0,2 – 0,3 мл/хв.
Подразнення гладеньком’язових клітин і відведення електричних потенціалів
здійснювали за допомогою хлор-срібних електродів (9, 10), які з’єднувалися з
розчинами через агарові містки, заповненні 2,5 мМоль КСІ. Один з подразнюючих
електродів розміщували в тест-ділянці, а другий електрод з’єднували з розчином
Кребса, що заповнює поліетиленову трубку. З метою зменшення шунтуючої дії
зазору між м’язовою смужкою і поліетиленовою трубкою, устя трубки змазували
вакуумною змазкою. Синаптичні потенціали в гладеньких м’язах морської свинки
викликали подразненням інтрамуральних нервових утворень, які знаходяться в
товщі м’язових смужок прямокутними імпульсами електричного струму вхідного або
вихідного напрямків тривалістю 0,5 – 1 мс. Джерелом струму служив стимулятор
ЕСУ-1. Для відведення електричних потенціалів від гладеньком’язових клітин один
із електродів поміщали в ділянку камери, яка була заповнена ізотонічним
розчином КСІ, а інший - в тест-ділянку. Електричну активність, що відводилась
подавали на вхід катодного повторювача, вхід якого з’єд