РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
Роботу виконано на 86 молодих статевозрілих (вік п’ять – шість місяців) самцях
кроля, отриманих із розплідника ДУ «Інституту проблем ендокринної патології ім.
В. Я. Данилевського АМН України». Репрезентативну вибірку тварин було
сформовано методом випадкового відбору тварин з генеральної сукупності,
розподіл на експериментальні групи проведено рендомним методом [36]. Тварин
утримували в стандартних умовах віварію. Дослідження проводили відповідно до
національних «Загальних етичних принципів експериментів на тваринах» (Україна,
2001) [24], що узгоджуються з положеннями «Європейської конвенції про захист
хребетних тварин, які використовуються для експериментальних та інших наукових
цілей» (Страсбург, 1985) [39].
Загальну схему проведення експериментів наведено на рис. 2.1.
Після визначення показників вихідного стану у піддослідних тварин моделювали
стан функціонального гіпопінеалізму. З цією метою їх утримували в умовах
цілодобового освітлення: вдень – звичайне сонячне світло, вночі – електричне
освітлення з використанням ламп розжарювання потужністю 100 Вт. Інтенсивність
освітлення в клітках, яку вимірювали за допомогою люксметру «Ю-117», складала
30 – 40 люкс.
Кролів розподілено на дві групи:
1. - інтактні, яких утримували в умовах природної зміни дня і ночі.
2. - кролі, яких протягом п’яти місяців утримували в умовах постійного
цілодобового освітлення.
Оскільки тривалість експерименту складала п’ять місяців (з лютого по липень),
природна довгота світлового дня також змінювалась. Співвідношення між світлим і
темним часом доби у дні забору крові виглядало наступним чином: лютий (9 год 40
хв світло : 14 год 20 хв темрява), березень (11.30 : 12.30),
мелатонін мелатонін
мелатонін мелатонін
Т3 Т4 Т Е2
Рис. 2.1. Схема проведення експерименту.
квітень (13.40 : 10.20), травень (15.15 : 8.45), червень (16.22 : 7.38), липень
(16.10 : 7.50). Контрольних тварин водночас із піддослідними також обстежували
в динаміці проведення експерименту.
З метою встановлення характеру змін добових ритмів гормональної активності
ендокринних залоз у контрольних та піддослідних тварин щомісячно двічі на добу
(опівдні при сонячному світлі та опівночі при червоному світлі) з крайової вени
вуха збирали кров для наступного визначення відповідних показників.
Для оцінки гормональної активності пінеальної залози у контрольних і
піддослідних кролів визначали концентрацію мелатоніну в крові імуноферментним
методом з використанням стандартних наборів (ELISA IBU GmbH, Germany).
Визначення проводили на фотометрі загального призначення Stat Fax 303 Plus
фірми «Awareness Technology INC» (США).
З метою оцінки гормональної активності гіпофізарно-тиреоїдної системи в
сироватці крові у контрольних і піддослідних тварин імуноферментним методом
визначали вміст загальних Т3 (трийодтиронін), Т4 (тироксин) та ТТГ
(тиреотропін) з використанням стандартних наборів: «Стероид ИФА –
трийодтиронин», «Стероид ИФА – трироксин» та «Тироид ИФА – ТТГ-1» фірми «Алкор
Био» (Росія) [27, 28, 29].
Для оцінки гормональної активності статевих залоз у сироватці крові визначали
вміст Т (тестостерон) та Е2 (естрадіол) з використанням стандартних
імуноферментних наборів «ООО Хема-Медика» (Росія) [30, 31].
Знеживлювання контрольних і піддослідних тварин проводили під наркозом
(тіопентал натрію) відповідно до умов евтаназії, зазначених в методичних
рекомендаціях МОЗ України [39].
Морфофункціональний стан епіфіза, щитовидної та статевих залоз у контрольних та
піддослідних тварин оцінювали на підставі даних їх гістологічного вивчення. З
цією метою органи піддавали фіксації в 10 % розчині формаліну, проводили через
спиртові розчини наростаючої концентрації та заливали у парафін, після чого
виготовляли зрізи товщиною 5 мкм, які фарбували гематоксиліном та еозином [38].
Вивчення мікропрепаратів проводили за допомогою мікроскопів Olympus BX-41
(Японія) та Axiostar (Zeiss, Німеччина). Додатковим критерієм оцінки
функціонального стану ендокринних залоз були показники вимірювання ядер їх
клітин, що здійснювали на комп’ютерних відображеннях мікропрепаратів, отриманих
за допомогою цифрової фотокамери Olympus C4040Z із програмним забезпеченням
Olympus DP-Soft.
З метою отримання даних, які б свідчили про те, чи є принципова можливість
нормалізувати (або хоча б суттєво поліпшити) змінені внаслідок дії тривалого
цілодобового освітлення гормональні та структурні показники, піддослідних
тварин повертали в умови природної зміни дня і ночі через два, три, та чотири
місяці після початку світлової експозиції. Обстежено такі групи тварин:
1. - інтактні, яких протягом п’яти місяців утримували в умовах звичайної зміни
дня і ночі.
2. - піддослідні, яких після двох місяців утримування в умовах цілодобового
освітлення повернули в умови природної зміни дня і ночі.
3. - піддослідні, яких після трьох місяців утримування в умовах цілодобового
освітлення повернули в умови природної зміни дня і ночі.
4. - піддослідні, яких після чотирьох місяців утримування в умовах цілодобового
освітлення повернули в умови звичайної зміни дня і ночі.
5. - піддослідні, яких після п’яти місяців утримування в умовах цілодобового
освітлення повернули в умови звичайної зміни дня і ночі.
З метою проведення пошуку фармакотерапевтичних засобів, спрямованих на
відновлення функціональної активності щитовидної та статевих залоз при
тривалому гіпопінеалізмі, на різних етапах пошкодження пінеальної залози
піддослідним кролям додатково до відновлення природного