Вы здесь

"Біохімічні механізми адаптації риб до умов водного середовища: аноксія, гіпоксія та фізичне навантаження"

Автор: 
Лущак Володимир Іванович
Тип работы: 
Дис. докт. наук
Год: 
2002
Артикул:
0502U000201
99 грн
(320 руб)
Добавить в корзину

Содержимое

РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ
Тварини. Лососів, Oncorhynchus mykiss, отримували з Lindwood Acres Trout Farm, Campbell Croft, Онтаріо, Канада. Риб утримували в аерованій дехлорованій водопровідній циркулюючій воді при температурі 12°С з фотоперіодом 12 год день/12 год ніч. Тварини були розміром 22-28 см та важили близько 250 ? 20 г. Їх годували комерційною стандартною їжею для лососів. Риб забивали сильним ударом по голові й або зразу ж використовували, або швидко зрізали білі м'язи, заморожували тканини в рідкому азоті та зберігали при температурі -80°С.
Скорпену Scorpaena porcus L., барабулю Mullus barbatus ponticus Essipov, cтавриду Trachurus mediterraneus ponticus Aleev, темного горбуля Sciaena umbra L. та ската морську лисицю Raja clavata L. відловлювали ставним неводом, або донною сіттю в Карадазькій бухті (Крим, Курортне, Феодосія) та утримували в басейнах із проточною морською водою. Риб забивали, перерізуючи мозок у місці контакту між його спинним та головним відділами.
Сріблястих карасів (акваріумну форму Сarassius auratus L. - вуалехвостів) масою 8-15 г купували в спеціалізованому магазині в м. Бразиліа (Бразилія) та годували комерційною стандартною їжею для цього виду.
Реактиви. У роботі використовували реактиви виробництва наступних фірм: Sigma (США), Boehringer Mannheim (Німеччина), Reanal (Угорщина) та вітчизняного об'єднання "Реахім" найвищої доступної чистоти.
2.1. Вивчення впливу факторів водного середовища на розподіл активності водорозчинних ферментів обміну вуглеводів та властивості їх вільних та зв'язаних форм.
Вивчення впливу гіпоксії на активність та розподіл між вільною та зв'язаною фракціями активності гліколітичних та асоційованих ферментів у тканинах барабулі. В даній роботі використовували барабулю (M.barbatus) масою 15-30 г на IV-V стадіях зрілості. Для дослідження впливу гіпоксії 8-10 риб переносили в термостатовану герметизовану камеру об'ємом 10 л та витримували в ній протягом 60 хв. при постійній подачі повітря прокачуванням за допомогою мікрокомпресора "Скалярій". Вміст кисню визначали цифровим двоканальним киснеміром виробництва малого підприємства "Сігма" (Харків). Безпосередньо перед роботою прилад калібрували: 100% насичення встановлювали на відкритому повітрі, а для установки "0" електрод занурювали у 2% розчин сульфіту натрію. Киснемір був з'єднаний з реєструючим потенціометром КСП-4 та зі спеціально сконструйованим електронним пристроєм, який вмикав подачу повітря мікрокомпресором при падінні концентрації кисню нижче заданого рівня. Одночасно брали у дослід контрольну партію риб. Після 60 хв. адаптації риб до умов камери її герметизували та приблизно протягом 60 хв. знижували рівень кисню у воді з 8,0-8,8 до 4,0-4,4 мг О2/л, тобто до 50% насичення. Тварин витримували в умовах 50% насичення киснем протягом 90 хв. При цьому підтримували температуру 17,5 ± 0,5°С, яка відповідала температурі морської води на час проведення експерименту. Попередньо встановили, що пониження температури води до 8°С призводило до падіння рівня глікогену та зміни активності лактатдегідрогенази та глюкозо-6-фосфатдегідрогенази в тканинах риби, тому температуру біля 17°С вибрали для проведення даних досліджень. Воду в акваріумі постійно перемішували з допомогою акваріумної помпи "Струмок". Риб забивали перерізанням хребтового стовпця ззаду голови.
Вміст глікогену та глюкози в тканинах барабулі визначали з використанням антрону [29] з деякими модифікаціями для глікогену із мозку. Для цього проби мозку тричі промивали розчином 80% етанолу та 20% хлороформу для видалення цереброзидів. Вміст лактату визначали ферментативним методом із використанням лактатдегідрогенази [29]. Час від перерізання хребтового стовпця до гомогенізації складав 120 с.
Гомогенати з тканин отримували наступним чином. Мозок та печінку вирізали та промивали в охолодженому фізіологічному розчині. До зваженої тканини, просушеної фільтрувальним папером, додавали 19-кратний об'єм (маса/об'єм) переохолодженого розчину наступного складу: 20 мМ Тріс-HCl (рН 7,6 при 20°С), 250 мМ сахарози, 1 мМ ЕДТА, 20 мМ NaF, 1 мМ дитіотрейтолу та 20 мкМ інгібітора протеаз фенілметилсульфонілфториду (ФМСФ). Три останні компоненти вносили в середовище гомогенізації безпосередньо перед дослідом: фторид натрію та S0,5 дитіотрейтол у вигляді сухих речовин, а ФМСФ у вигляді свіжоприготованого розчину в етиловому спирті. Через 120 с після перерізання хребтового стовпця наважки мозку чи печінки гомогенізували у скляному гомогенізаторі Поттера протягом 15 с до отримання однорідної суспензії. Частину гомогенатів залишали, а частину переносили в центрифужні пробірки та центрифугували в центрифузі Hitachi із прискоренням 45000 g протягом 15 хв.
Активність гліколітичних ферментів та Г6ФДГ визначали спектрофотометричним способом, реєструючи зміну оптичної густини при довжині хвилі 340 нм при окисленні чи відновленні НАД+ при 25°С на спектрофотометрах "Specord M-40" фірми "Carl Zeiss Jena" (Німеччина), та СФ-46 (ЛОМО, Ленінград, СРСР) в кюветах об'ємом 1 та 3 мл відповідно.
Для визначення активності ферментів були використані наступні умови [29]:
Гексокіназа (ГК): 50 мМ Тріс-HCl буфер (рН 7,5 при 25°С), 10 мМ глюкоза, 2,5 мМ АТФ, 15 мМ MgCl2, 0,5 мМ НАДФН, надлишок глюкозо-6-фосфатдегідрогенази та 50 мкл гомогенату або суспензії. Реакцію починали внесенням АТФ.
Фосфофруктокіназа (ФФК): 50 мМ Тріс-HCl буфер (рН 8,0 при 25°С), 1 мМ АТФ, 0,1 мМ ЕДТА, 0,3 мМ фосфоенолпіруват, 1 мМ фруктозо-6-фосфат, 50 мМ КCl, 4 мМ (NH4)2SO4, 6 мМ MgCl2, 1 мМ дитіотрейтол, 160 мкМ НАДН, надлишок піруваткінази і лактатдегідрогенази та 10 мкл/мл гомогенату чи супернатанту. Реакцію починали внесенням фруктозо-6-фосфату.
Піруваткіназа (ПК): 50 мМ Тріс-HCl буфер (рН 7,5 при 25°С), 1 мМ фосфоенолпіруват, 10 мМ MgCl2, 100 мМ КCl, 2 мМ АДФ, 160 мкМ НАДН, надлишок ЛДГ, 5 мкл/мл гомогенату або супернатанту при роботі з мозком і 10 мкл/мл при роботі з печінкою. Реакцію починали внесенням фосфоенолпірувату.
Лактатдегідрогеназа (ЛДГ):