РОЗДІЛ 2
ПРОГРАМА, ОБ'ЄКТИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
2.1. Програма досліджень
Для вивчення особливостей міжклітинної взаємодії умовно-патогенних спорооутворюючих бактерій роду Bacillus у процесі онтогенезу та визначення факторів регуляції та ауторегуляції при мікро- або макроциклічному шляху розвитку клітин в мікропопуляції чи періодичній культурі було використано комплекс сучасних існуючих та розроблених нами нових методів бактеріологічного дослідження. Для розуміння доцільності та послідовності проведених нами досліджень слід навести програму, за якою здійснювали експерименти.
Експериментальні дослідження починали з культивування спороутво-рюючих аеробних бактерій, отримання біомаси спор, розробки методів їх мікрокультивування та можливості спостереження за їх ростом, розвитком на прикладі однієї бактеріальної клітини. Одним із важливих етапів дослідження було вивчення процесу спороутоворення як своєрідного етапу розвитку мікробної клітини та встановлення факторів, які впливають на формування спори.
Було досліджено динаміку формування агрегатів клітин у процесі розвитку періодичної макрокультури та механізми такої взаємодії як своєрідного прикладу міжклітинних контактів, його залежність від показників рН поживного середовища та інших факторів. Важливими також були дослідження мікробіологічних об`єктів за допомогою растрового електронного мікроскопу для встановлення особливостей міжклітинної взаємодії спороутворюючих бактерій у процесі розвитку періодичних культур та визначення змін вмісту та біологічної ролі окремих хімічних елементів та біополімерів у бактеріальних клітинах і культуральній рідині.
Вивчення хімічного складу спороутворюючих бактерій на різних етапах їх розвитку здійснювали із застосуванням сучасних методів аналізу на основі рентгеноспектралього мікроаналізатора з попереднім відпрацюванням оптимальних умов дослідження. Важливим було встановити обмін окремих хімічних елементів на певних фазах розвитку періодичних культур спороутворюючих бактерій різних видів.
Принципово було дослідити розвиток мiкрокультури спороутворюючих бактерiй в умовах їх культивування у камерах для мiкрокультивування бактерiй, встановити термін зберігання спор в лабораторних умовах, дослідити ососбливості розвитку періодичних культур , які вирощували із спор з різним терміном зберігання (протягом 25 років).
Для з'ясування механізмів формування міжклітинних зв'язків у бактеріальних агрегатах здійснювали біохімічні та електрофоретичні дослідження біополімерів поверхневих шарів клітинних стінок і розчинних полімерів культуральної рідини. Такі експериментальні дослідження також проводили з мікроорганізмами різних штамів та видів при їх періодичному культивуванні.
Процеси управління розвитком мікрокультур спороутворюючих бактерій вивчали з використанням та врахуванням факторів міжклітинної взаємодії бактеріальних клітин, проведено пошук принципових підходів до управління розвитком мікроорганізмів на моделі спороутворюючих бактерій в межах як мікроциклічного, так і макроциклічного їх розвитку.
Така програма досліджень дозволила, по-перше, обгрунтувати доцільність використання мікробіологічної моделі для вивчення процесів міжклітинної взаємодії як загальнобіологічного явища та провести пошук можливих механізмів її регулювання, а, по-друге, встановити нові закономірності в розвитку клітин та дослідити можливості в управлінні їх диференціацією.
2.2. Характеристика штамів мікроорганізмів та методи їх культивування
2.2.1. Штами мікроорганізмів. У дослідженнях використовували еталонні штами аеробних спороутворюючих мікроорганізмів, які були отримані із ДНДІСК ім. Л.О. Тарасевича (РФ, м. Москва). Це такі штами: B. mesentericus 66, B.mesentericus 1027 type "E", B.mesentericus 1026 type "E", B.mesentericus 1026 type "D", B.cereus 504, B.cereus ССM, B. cereus 2527, B. cereus 4/43, B.cereus 8035, B. cereus 24, B. megaterium 654, B. megaterium 2550, B. megaterium 89, B.subtilis 83, B. subtilis 7241.
Крім того вивчалась культура оригінального штаму мікроорганізмів - B.megaterium H, який був виділений із грунту чл.-кор. НАН України Затулою Д.Г. Відмінною особливістю даного штаму є те, що його спорова і вегетативна форма мають перехресно-реагуючі антигени з тканинами злоякісних пухлин [36]. Також вивчалась культура B.mesentericus AB-56, яка мала антагоністичні властивості відносно штаму B.megaterium H. Обидва штами отримані із музею живих культур Інституту мікробіології та вірусології ім. Д.К.Заболотного НАН України. Крім того, використовували штами Bacillus spр., Streptococcus pyogenes, отримані на кафедрі епідеміології Національного медичного університету ім. О.О. Богомольця.
Більшість наведених штамів є типовими представниками роду Bacillus, тобто грампозитивні палички, рухливі, невимогливі до поживного середовища, мають переважно перитрихіально розташовані джгутики, утворюють ендоспори, які розташовуються центрально, субтермінально, а іноді термінально, добре культивуються на основних поживних середовищах, колонії мають R-форму.
Дані мікроорганізми активно продукують різноманітні гідролітичні та протеолітичні ферменти, у зв'язку з чим можуть використовувати для живлення широкий спектр органічних речовин (білки, вуглеводи, органічні кислоти тощо). Тому саме на цих мікроорганізмах доцільно було вивчати особливості розвитку періодичних мікро- та макрокультур в лімітованих за поживними речовинами умовах культивування протягом тривалого часу.
Вибрані штами бацил належать до аеробів, оптимальна температура росту становить 30?-37? С при показниках рН середовища - 7,0-7,2. Перераховані штами бацил відрізнялися тим, що їх спори проростали з різною швидкістю та різною синхронністю, а протилежний процес - спороутворення, також відрізнявся за інтенсивністю та продуктивністю.
Таким чином, в залежності від задачі експерименту, можна було використовувати різні штами, що дозволяло досягти успішного блокування генів вегетації т