РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
2.1. Матеріали та реактиви, які були використані в роботі
При виконанні роботи були використані наступні реактиви:
поліетиленгліколь 6000, уранілацетат, полівінілформальдегід, кумасі блакитний
R- 250, 1,2 – фенілендиаміндигідро - хлорид, N-n-нітрофенілфосфат, тритон Х-100
("Serva", CШA);
додецилсульфат натрію, 4 – хлор – 1 - нафтол ("Merck", Німеччина);
набір маркерних білків LMW ("Pharmacia", Швеція);
повний ад’ютант Фрейнда, неповним ад’ютантом Фрейнда ("Sigma", СІЛА);
кіт для тотального виділення РНК ("Promega" ,CШA);
кіт "Ready – To - Go™ RT - PCR Beads" ("Amersham pharmacia biotech", США);
кіт "DNAce Spin PCR Pure Kit Sample" ("Bioline", UK);
трипсин ("Millipore",CШA);
нітроцелюлоза мембрана ("Schleicherand Schuell", Німеччина)
гліцин, акриламід, біс-акриламід, понсо ("BDH", Англія);
неорганічні компоненти буферних систем вітчизняного виробництва марок
"хч"та"чда";
96-лункові планшети ("Labsystems", Фінляндія);
антитіла проти імуноглобулінів кроля, конюговані з ПХ (“Bio - Rad”, США).
2.2. Відбір зразків
Метод виявлення та відбору рослинного матеріалу за зовнішніми симптомами є
найпростішим і найпоширеним методом. Він заснований на здатності багатьох
вірусів викликати на рослинах характерні симптоми ураження, які проявляються у
вигляді смуг на листових пластинках, їх деформацій, вкорочення стебел та
пагонів, зміні забарвлення листя, появі некротичних плям на листках та ін.
Для дослідження вірусів тропічних і субтропічних рослин з плантацій
сільськогосподарських культур (чорний перець, а також маш, маніок, соя та ін.)
відбирали зразки культурних рослин та ґрунту в трьох повторностях з трьох точок
методом рендомізованого польового експерименту, та вносили в стерильний пакет.
Для препаративного виділення та накопичення вірусів відбиралися зразки
культурних рослин та рослин-індикаторів з візуальними симптомами вірусного
ураження. Відбирали зразки з оранжерей ботанічного саду імені О. В. Фоміна
Київського національного університету імені Тараса Шевченко.
Дослідження проводилися в чотирьох головних провінціях Південного В’єтнаму: у
провінції Бінь - Фуок, у провінції Донг - Най, провінції Вунг - Тау, і острів
Фу - Куог.
2.3. Виділення та очистка вірусних препаратів
Виділення вірусного матеріалу проводили шляхом гомогенізації свіжозаморожених
інфікованих рослин в 0.1 М калій - фосфатному буфері (К2НР04 - КН2РО4), рН 7.4,
з додаванням 0.01 М Na2SO3, освітленням хлороформом вірусного екстракту у
співвідношенні 1:7 та подальшим низько швидкісним центрифугуванням протягом 20
хв при 4 тис. об/хв на центрифузі РС - 6. Концентрування препарату проводили за
допомогою інкубації надосадової рідини на магнітній мішалці з додаваням 5%
поліетиленгліколя 6000 ("Serva", США) та 1.2% NaCl протягом 60 хв при 4°С.
Після інкубації режим центрифугування становив 10 тис об/хв протягом 15 хв. У
подальшому осад ресуспендували в 0.01 М калій-фосфатному буфері, рН 7.4, з
подальшим високошвидкісним центрифугуванням в режимі 30 тис об/хв протягом 1.5
год на центрифузі "Beckman", ротор SW - 40. Відбирали осад, який знову
ресуспедували в 0.01 М калій-фосфатному буфері та проводили через сахарозну
подушку при ЗО тис об/хв протягом 2.5 год на тому ж роторі. Осад ресуспендували
в 0.01 М тріс - НСІ, рН 7.6, та діалізували протягом ночі при 4°С проти 0.01 М
тріс - НСІ. При роботі з вірусним матеріалом були використані буфери, що не
містять солей для зручності в подальшому виділенні нуклеїнової кислоти та
білку. Концентрацію вірусу визначали спектрофотометрично за формулою:
С = A260*N/Kg
де С - концентрація вірусу в мг/мл,
А260 - екстинкція при довжині хвилі 260 нм,
N - розведення вірусного препарату,
Kg - коефіцієнт екстинкції, що для ВТМ становить 2.7 [15, 42].
2.4. Рослини - індикатори
Для оцінки інфекційних властивостей вірусів та накопичення їх для електронної
мікроскопії використовували метод рослин-індикаторів. Для накопичення вірусу
брали молоді рослини :
Datura stramonium (на стадії чотирьох справжніх листків), які дають симптоми
мозаїки, яка іноді супроводжується некрозами для ХВК, мозаїки для ВТМ;
Nеkotiana tоbaсum, сорту Trapeson, які дають симптоми деформації та мозаїки для
ВТМ, мозаїки, іноді деформації для ХВК, посвітління жилок, мозаїки, затримки
росту УВК; Chenopodium amaranticolor, які дають некротичну реакцію для ВТМ.
Зараження рослин проводили механічно для таких вірусів як ВТМ, ХВК, УВК.
Симптоми вірусних захворювань спостерігалися через 3 - 18 днів після зараження
[54].
2.5. Електронна мікроскопія
Для вивчення морфології вірусів застосовувалися трансмісійні електронні
мікроскопи JEM-1200 (JEOL, Японія) JEM-100В (JEOL, Японія), ЕМ - 125 (Суми,
Україна) з негативним контрастуванням вірусних часточок.
Для виготовлення плівок-підкладок використовували 0,2 % розчин форм вару
(полівінілформальдегіду) в хлороформі. Для негативного контрастування
використовували розчини солей важких металів: 2% розчин фосфорно вольфрамової
кислоти (ФВК) рН 7-7,4 та 2% розчин ураніл ацетату в дистильованій воді [7,3].
На сіточку з плівкою наносили краплю вірусовмісної суспензії вірусних часточок.
Рідину відсмоктували фільтрувальним папером та 30 - 60 с сіточку сушили на
повітрі. Потім на неї наносили краплю контрастуючої речовини та через 1 хв
відсмоктували рідину, після чого препарат використовували для досліджень в
електронному мікроскопі [51].
2.6. Імуноферментний аналіз
Для отримання числових результатів на стадії обробки польових злаків
використовували непрямий метод постановки das-ELISA[1,2]. Для його проведення
використовували антитіла, специфічні до слілуючих вірусів:
Х - вірус картоплі (ХВК);
М - вірус картоплі (МВК);
S - вірус картоплі (SBK);
- Киев+380960830922