Содержание
2
1 Содержание
1 Содержание 2
2 Список сокращений 5
3 Введение 6
3.1. Актуальность темы 6
3.2. Цели и задачи исследования 7
3.3. Научная новизна 8
3.4. Практическая значимость 8
3.5. Основные положения диссертационной работы, выносимые на защиту 8
3.6. Апробация работы 9
3.7. Публикации 9
4 Обзор литературы 10
4.1. Характеристика норганичнон болезни овец 10
4.1.1. Историческая справка и экономическая значимость болезни 10
4.1.2. Эпизоотология ИБО 10
4.1.3. Патогенез ИБО 11
4.1.4. Клиническое проявление ПБО 15
4.1.5.1 Еатологоанатомическая картина при ПБО 15
4.1.6. Иммунитет при ПБО 16
4.1.7. Профилактика и меры борьбы при ПБО 17
4.2. Характеристика возбудителя ПБО 18
4.2.1 .Таксономическое положение вируса ПБО 18
4.2.2. Физико-химические свойства вируса ПБО 19
4.2.3. Генетическая структура вируса ПБО 19
4.2.4. Молекулярная биология вируса ПБО 20
4.2.5. Антигенное и генетическое родство вируса ПБО с другими
пестив ярусам и 21
4.3. Диагностика ПБО 25
4.3.1. Вирусологические методы исследования 25
4.3.1.1. Выделение вируса ПБО в культуре клеток 26
4.3.1.2. Методы обнаружения антигена вируса ПБО иммуноферментным анализом 27
4.3.1.3. Обнаружение и идентификация вирусной РНК 28
4.3.2. Методы выявления специфических антител 30
Содержание
3
4.3.2.1. Реакция нейтрализации 31
4.3.2.2. Методы на основе иммуноферментного анализа 31
4.3.3. Дифференциальная диагностика 33
4.4. Заключение по обзору литерату ры 33
5 Собственные исследования 34
5.1. Материалы 34
5.1.1. Вирусы 34
5.1.2. Животные 35
5.1.3. Культуры клеток 3 6
5.1.4. Питательные среды 36
5.1.5. Сыворотки 36
5.1.6. Ферменты 37
5.1.7. Химические реактивы 37
5.1.8. Оборудование 37
5.2. Методы 39
5.2.1. Культивирование вирусов 39
5.2.2. Титрование вирусов 39
5.2.3. Получение специфических антисывороток 39
5.2.4. Приготовление очищенных IgG 40
5.2.5. Оценка прокоагулянтной активности лейкоцитов 40
5.2.6. Постановка реакции торможения миграции лейкоцитов 41
5.2.7. Получение фракции лейкоцитов крови 41
5.2.8. Постановка PH для титрования антител. 42
5.2.9. Определение антигенного родства . 42
5.2.10. Исследование полевых сывороток крови овец и коз 42
5.2.11. Компьютерный анализ, расчет олигонуклеотидов ' 42
5.2.12. Синтез кДНК и клонирование 43
5.2.13. Постановка ОТ-ПЦР 43
5.2.14. Электронная микроскопия вируса ИБО 44
5.2.15. Определение концентрации белка 44
5.2.16. Коныогирование IgG с ФИТЦ 44
5.2.17. Лиофилизация биологических материалов 44
5.2.18. Методы статистической обработки данных 44
5.3. Результаты собственных исследований 45
5.3.1. Культивирование вируса ПБО in vitro 45
5.3.1.1. Выбор наиболее чувствительной клеточной системы для культивирования вируса ПБО 45
5.3.1.2. Изучение динамики накопления вируса ПБО в культуре клеток 48
5.3.1.3. Оптимизация условий культивирования вируса ПБО в культуре клеток 5 3
5.3.2. Лиофилизация вируса ПБО 58
5.3.3. Концентрирование, очистка и электронная микроскопия вируса ПБО 59
Обзор литературы
14
При многих остропротекающих инфекциях ведущим звеном в патогенезе являются аллергические реакции, в том числе гиперчувствительность замедленного типа (ГЗТ). ГЗТ - это зависимая от Т-клеток иммунологическая реакция, проявляющаяся в виде воспаления в месте попадания в организм антигена. В формировании ГЗТ можно выделить афферентную (индукционная фаза) и эфферентную (фаза проявления) стадии. Афферентная стадия включает сложную последовательность событий, начинающуюся представлением антигена иммунологически интактным животным. Эта фаза развивается в течение нескольких дней и завершается с появлением у животного регистрируемых реакций фазы проявления. Эфферентная стадия характеризуется классическими гистологическими изменениями под действием лимфокинов, освобождаемых эффекторными Тгзт-клетками после антигенной стимуляции. Максимальная интенсивность реакции при этом достигается через 24-48 часов после инициации. Целесообразность или полезность ГЗТ, как и других аллергических реакций, заключается в выявлении и ограничении зоны действия вирусного антигена, то есть в локализации инфекции при воспалении. Однако, поскольку аллергия в значительной мерс обусловливает всю картину болезни, чрезмерное развитие ГЗТ может приводить к тяжелым патологическим проявлениям (13, 69).
Одним из основных медиаторов воспалительного процесса, характерного для ГЗТ, является фактор торможения миграции лейкоцитов, продуцируемый Тгзт-клетками. Результаты реакции TMJI in vitro хорошо коррелирую'!' с развитием ГЗТ in vivo (13, 127).
При ряде вирусных инфекций, таких как африканская чума свиней, клещевой энцефалит, лихорадка денге, лихорадка Хунин, обнаружена корреляция между выраженностью реакций ГЗТ и тяжестью течения болезни, или прямо показано участие ГЗТ в их патогенезе. Установлено, что при сверхострой и острой формах течения болезни регистрируется сильное торможение миграции лейкоцитов, достигающее 98%. При бессимптомной инфекции торможение не превышает 30%. При классической чуме свиней степень проявления гиперчув-ствителъности замедленного типа коррелирует с исходом болезни. У животных со сверхострой и острой формами течения болезни торможение миграции лейкоцитов превышает 65% (13). В отношении других пестивирусных инфекций информации по данному вопросу не найдено.
Обзор литературы
15
4.1.4. Клиническое проявление ПВО
В постнатальном периоде ПБО, за редким исключением, протекает у овец субклинически и, как правило, проходит незамеченной. Распространение ПБО в стаде сопровождается большим процентом бесплодия, абортами, но характерные клшшческие симптомы обнаруживаются, как правило, только при окоте (24, 26, 27, 137, 165, 232).
Клинические признаки у новорождешшх ягняг, конгенитально инфицированных вирусом ИБО, значительно варьируют. Одновременно могут рождаться как внешне здоровые, так и тяжело больные, погибающие в первые дни жизни ягнята. Основными признаками ИБО являются неправильная форма тела, преобладание в руне грубых шерстных волокон и поражения ЦНС, которые варьируют от непродолжительного легкого тремора и потряхивающих движений головы и хвоста, или только ушей, до тяжелых клонико-тонических мышечных контрактур всего тела, особенно головы и шеи. Таких ягнят называют «волосатыми шейкерами» (трясунами) (26, 32, 141, 147, 174). При этом они высоко чувствительны к вторичным инфекциям, особенно к паразитарным и бактериальным. Также были сообщения о заболевании овец с клинической картиной, сходной с таковой при болезни слизистых у КРС. Во время таких вспышек у ягняг наблюдалась изнурительная диарея, угнетение и большинство из них погибало в первые дни после рождения (25, 98,125,174).
4.1.5. Патологоанатомическая картина при ПБО
Постнатальная инфекция, в естественных условиях, обычно не сопровождается какими-либо патологоанатомическим изменениями. Однако были сообщения о двух особо вирулентных изолятах вируса ПБО, которые обладали способностью вызывать фатальную инфекцию, сопровождающуюся геморрагическими изменениями в тканях ряда органов (25, 65, 137, 144).
Инфекционный процесс у суягных овцематок может сопровождаться изменениями в плаценте, которые, в одних случаях могут быть хорошо заметными при патологоанатомическом вскрытии, а в других - выявляться лишь при гистологическом исследовании (26, 165). При этом регистрируется некротическое воспаление карункулов, включая капиллярный некроз с набуханием эндотелия и тромбозом, иногда с вовлечением в этот процесс стромы карункулов.
- Київ+380960830922