Разработка и унификация методик анализа и стандартизации препаратов инсулина с использованием обращенофазовой жидкостной хроматографии высокого давления (ОФ ЖХВД)

- 2 -
ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ...........................................................4
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.........................................11
1. Роль инсулина в лечении сахарного диабета...................11
2. Биосинтез и биологическое действие инсулина.................12
3. Общая характеристика физико-химических и фармацевтических свойств инсулина..............................................15
4. Препараты инсулина...........................................24
5. Методы производства, стандартизации и контроля качества препаратов инсулина...........................................31
6. Применение ЖХВД в фармацевтическом анализе инсулина.... 46
ГЛАВА 2. ПОСТАНОВКА ЗАДАЧИ........................................50
ГЛАВА 3. ИЗУЧЕНИЕ ВЛИЯНИЯ РАЗЛИЧНЫХ ФАКТОРОВ НА ХРОМАТОГРАФИЧЕСКОЕ ПОВЕДЕНИЕ ИНСУЛИНА В УСЛОВИЯХ ОФ ЖХВД 56
1. Методы и материалы..........................................57
2. Обсуждение результатов......................................62
2.1. Влияние компонентного состава буферного раствора .. 62
2.2. Влияние концентрации натрия сульфата .................. 68
2.3. Влияние температуры хроматографической колонки .... 70
2.4. Влияние органического модификатора .................... 75
2.5. Влияние длины алкильного радикала привитой фазы ... 80
2.6. Влияние длины хроматографической колонки .............. 80
3. Выводы.......................................................81
ГЛАВА 4. СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ ФАРМАКОПЕЙНЫХ МЕТОДИК АНАЛИЗА ПРЕПАРАТОВ ИНСУЛИНА, ОСНОВАННЫХ НА ПРИМЕНЕНИИ ОФ ЖХВД........82
1. Выбор оптимальных условий хроматографического определения инсулина и его примесей в лекарственных препаратах............82
2. Метрологические характеристики методики......................84
- З -
3. Применение разработанной методики для испытания официнальных препаратов инсулина..............................95
4. Выводы.......................................................106
ГЛАВА 5. РАЗРАБОТКА МЕТОДИК АНАЛИЗА ИНЪЕКЦИОННЫХ ЛЕКАРСТВЕННЫХ ФОРМ ИЗОФАН-ИНСУЛИНА НА ОСНОВЕ МЕТОДА ОФ ЖХВД.....................107
1. Выбор условий хроматографического определения протамина з лекарственных формах изофан-инсулина.........................110
2. Изучение хроматографических профилей протаминов, выделенных из различных видов рыб............................121
3. Методика определения протамина в препаратах изофан-инсулина.....................................................123
4. Валидация разработанной методики.............................125
5. Выводы.......................................................134
ОБЩИЕ ВЫВОДЫ......................................................136
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.................................................139
ПРИЛОЖЕНИЕ........................................................154
- 14 -
Проинсулин
Спептиа
Рисунок 1. Схема конверсии проинсулина в инсулин in vivo.
С помощью клинообразных стрелок показано действие ферментов.
Ряд исследований показали, что зрелая (5-гранула содержит инсулин, С-пептид, проинсулин, интермидиаты проинсулина, ионы цинка и ряд других соединений, содержание которых незначительно. Инсулин сохраняется в (3-грануле в форме цинксодержащего гексамера вплоть до секреции. Секреция инсулина протекает по механизму экзоцитоза [27,141].
Биосинтез инсулина в р-клетках и его секреция в организме регулируются субстратами энергетического и пластического обмена, а так же рядом других гормонов, в том числе самим инсулином, действуя по механизму обратной связи. Наиболее мощный регулятор - глюкоза, постоянно присутствующая в крови в концентрации 5,5 ммоль/л. Концентрация инсулина в плазме крови колеблется от 1СГ9 до 10‘12 М (от 10 до 25 мкЕД/мл) [141,148].
Инсулин влияет на обмен углеводов, жиров, белков и электролитов практически во всех тканях организма [27].
Молекулы инсулина воздействуют на внутриклеточные биохими-
- 15 -
ческие процессы посредством рецепторов [27,141]. Последние представляют собой участки клеточной мембраны с генетически обусловленным макромолекулярным сродством к гормону [27,141]. Наличие рецепторов инсулина установлено в клетках печени, жировой ткани, мышц, плаценты, головного мозга и других тканей, а также в клетках крови - лимфоцитах, моноцитах и эритроцитах [27]. Рецепторы инсулина клеток разных органов наделены универсальной структурой. Не выявлено наличия специфичности рецепторов печени теленка, гвинейской свинки и цыпленка к гомологичным инсулинам, что свидетельствует об отсутствии видоспецифических рецепторов [27]. Благодаря универсальности структуры рецепторов инсулина этот гормон способен оказывать биологическое действие на органы-мишени различных млекопитающих.
Инактивация инсулина происходит в основном в печени под воздействием энзиматической системы, источник которой в гепа-тоцитах - лизосомы [27,141].
3. Общая характеристика физико-химических и фармацевтических свойств инсулина
С химической точки зрения инсулин представляет собой небольшой глобулярный белок с молекулярной массой до 6000 Да. При этом следует отметить, что инсулин - это общее название для целого семейства гомологичных белков природного и искусственного происхождения с общей характерной биологической активностью.
Белковая природа инсулина установлена в 1928 г [52]. Он относится к числу белков, дающих биуретовую реакцию и реакцию Паули. Строение инсулина было полностью установлено в начале 50-х годов. Элементарный химический состав инсулинов различно-