2
ОГЛАВЛЕНИЕ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.................................................5
1. ВВЕДЕНИЕ.......................................................8
2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ..............................................11
2.1. Возбудитель сибирской язвы и факторы его патогенности.....11
2.2. Общие сведения о бактериальных токсинах...................16
2.2.1. Роль гемолизинов в патогенезе и их биологическое действие.. 18
2.2.2. Природа и физико-химические свойства гемолизинов.......22
2.2.3. Механизм действия бактериальных токсинов на клетку.....25
2.2.4. Стимуляторы и ингибиторы гемолитической активности 40
2.2.5. Методы изучения гемолитической активности патогенных микроорганизмов...........................................43
2.3. Гемолизины микроорганизмов рода Bacillus..................49
2.3.1. Гемолизины Bacillus cereus.............................49
2.3.2. Гемолизины Bacillus anthracis..........................57
2.4. Заключение но обзору литературы...........................60
3. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ......................................61
3.1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ........................................61
3.1.1. Материалы..............................................61
3.1. 1.1. Штаммы микроорганизмов............................61
ЗАЛА, Питательные среды.....................................61
3.1.1.3. Ферменты...........................................62
3.1.1.4. Реактивы...........................................63
3.1.1.5. Растворы...........................................63
3.1.1.6. Сыворотки..........................................63
3.1.1.7. Лабораторное оборудование..........................63
ЗА А. 8. Животные...........................................64
3.1.2. Методы.................................................64
3.1.2А. Получение спорового материала.......................64
3.1.2.2. Определение концентрации жизнеспособных спор.......64
3.1.2.3. Получение фильтратов бульонных культур.............64
3.1.2.4. Определение гемолитической активности..............65
3
3.1.2.5. Определение лецитиназной активности...............66
3.1.2.6. Концентрирование экзопродуктов фильтратов бульонных культур...............................................66
3.1.2.7. Очистка гемолитически активных экзопродуктов методом хроматограф и и.......................................66
3.1.2.8. Выделение бактериальной ДНК.......................67
3.1.2.9. Постановка ПЦР....................................67
3.1.2.10. Молекулярное клонирование фрагментов ДНК.........68
3.1.2.11. Экспрессия рекомбинантных белков.................68
3.1.2.12. Определение концентрации белка...................69
3.1.2.13. Электрофорез в полиакриламидном геле.............69
3.1.2.14. Получение специфических сывороток................69
3.1.2.15. Определение полипептидиой специфичности методом иммуноблоттинга.......................................69
3.1.2.16. Статистическая обработка результатов.............70
4. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ......................71
4.1. Изучение условий, влияющих на экспрессию гемолизинов B.anthracis.................................................71
4.1.1. Подбор питательных сред для получения внеклеточных гемол из иное В. ant/и ас is..............................72
4.1.2. Динамика экспрессии гемолитически активных экзопродуктов. ..........................................................76
4.1.3. Изучение индуцирующего действия О2 и С02на экспрессию гемолизинов B.anthracis...................................77
4.2. Изучение факторов, влияющих на литичсскую активность экзотоксинов сибиреязвенного микроба........................79
4.2.1. Влияние температуры на литическую активность гемолизинов B.anthracis...............................................79
4.2.2. Определение динамики лизиса эритроцитов...............82
4.2.3. Влияние холестерина, СаС12, ЭДТА,ДТТ на цитолитическую активность экзотоксинов культур B.anthracis...............83
13
ПА+ЛФ или ПА+ОФ за счет рецепторно-опосредованного эндоцитоза переносится в клетку-мишень. Ингибирование фагоцитирующей функции, гибель макрофагов и полимофноядерных нейтрофилов происходит либо вследствие продуцирования активных форм кислорода, что сопровождается нарастанием уровня перекисных соединений в макрофагах (ПА+ЛФ), либо вследствие обезвоживания клеток и экскреции источников энергии в результате повышения внутриклеточного уровня цАМФ (Г1А+ОФ) (Абалакин В.А. и др. 1989; Masure H.R. et al., 1987). При гибели макрофаги вырабатывают большое количество цитокинов, регуляторов клеточного звена иммунитета (фактор некроза опухоли и интерлейкин). Значительный выброс медиаторов токсического шока приводит к гибели пораженный организм (Кравченко Т.Б. и др., 1997). Анализ результатов исследований позволил отнести сибиреязвенный токсин к категории известных бифункциональных (бинарных) токсинов, механизм действия которых в полной мере укладывается в рамки так называемой A-В структурной модели, описанной для токсинов Cl. tetani, V. cholerae, C. diphtheriae. В качестве В-субъединицы в данном случае выступает протеолитически активированный ПА, а в качестве субъединицы А - ЛФ или ОФ (Fitzgerald D. et al., 1982; Hanna P.C. ct al., 1994).
Сибиреязвенный токсин, оказывает иммунодепрессивное действие, подавляя фагоцитоз бактерий полиморфноядерными клетками, бактерицидное действие свежей дефибрииированиой крови в отношении вегетативных форм, повреждая мононуклеарные фагоциты в первичной культуре перитонеальных макрофагов морской свинки и лейкоцитов человека и вызывая местную воспалительную реакцию в виде отека тканей. При изучении действия токсина B.anthracis на энергетический обмен тканей животных показано, что токсин тормозит индуцированную аденозиндифосфатом агрегацию, что выражается в достоверном увеличении количества свободных тромбоцитов в плазме по сравнению с контрольными пробами. Кроме того, токсин вызывает изменения ферментативных систем тканей животных и др. В опытах на обезьянах установили, что при аэрогенном инфицировании спорами B.anthracis наблюдается повреждение сосудов с отеком, геморрагиями и тромбозом в результате повышения под действием токсина проницаемости эндотелиальных клеток для плазмы, т.е микроциркуляторные нарушения и повышенная проницаемость сосудов являются важным звеном патогенеза сибиреязвенной интоксикации.
Из трех субъединиц сибиреязвенного экзотоксина лишь ПА обладает выраженными иммуногенными свойствами и обусловливает формирование иммунитета к этой инфекции по типу антитоксического (Stanley J.L. et al., 1963). При взаимодействии антител с ПА блокируется возможность его
14
прикрепления к клеткам-мишеням, что предотвращает дальнейшую протеолитическую активацию, формирование токсических комплексов и транслокацию ЛФ или ОФ в цитозоль, предохраняя лабораторных животных от гибели при их заражении вирулентными штаммами В. anthracis. Кроме того, антитела к ПА в некоторой степени блокируют прорастание спор возбудителя, попавших в иммунный организм. Эти свойства позволили использовать препараты на основе ПА в качестве химических сибиреязвенных вакцин (Friedlandcr A.M., 1993).
К числу наиболее важных факторов инвазивности, влияющих на тяжесть течения болезни при их взаимодействии с клетками и тканями восприимчивого организма, относят способность патогенов продуцировать протеазы, гемолизины, ферменты пигментосингеза, пигментосорбции, способность к адгезии на поверхности клеток и др. (Завирюха А.И. и др., 1978; Степанов A.C. и др., 1991; Sasakawa Ch. et. al, 1986; Finlay B.B. et al., 1989; Ivins B.E. et. al., 1990; Lantz M.S., 1997). Сибиреязвенный микроб в этом отношении также не является исключением и эти свойства Bacillus anthracis рассматриваются рядом отечественных и зарубежных авторов в качестве гипотетических факторов патогенности, кодируемых генами хромосомной локализации.
Некоторые авторы считают синтез экзопротеаз характерной чертой В.anthracis. С одной стороны, у вирулентных сибиреязвенных культур протсолиз более активный, чем у слабовирулентных штаммов. С другой стороны, изогенные штаммы В.anthracis, различающиеся по протеолитической способности, имеют разную вирулентность.
Общепринято, что отсутствие гемолитических свойств у В.anthracis является наиболее постоянным биохимическим признаком. Однако этот признак у разных штаммов вариабелен. В отличие от других почвенных бацилл, в частности B.cereus, сибиреязвенные бациллы в бульоне, содержащем кровь, и на кровяном агаре не разрушают эритроциты барана или лизируют их очень медленно. В то же время вирулентные штаммы В.anthracis, независимо от того, выращиваются они в присутствии углекислого газа или в обычных условиях, проявляют гемопептическое действие, которое отмечается на агаре Хоттингера с 5% крови барана или на агаризированной среде с 15% дефибринированной крови. Степановым с соавт. ( Степанов A.C. и др., 1989) установлена детерминированность синтеза гемолизина (Н1у) и гемагглютининов (Hag) генами, расположенными на хромосоме.
При изучении популяционного состава различных изолятов сибиреязвенного микроба Н.И. Микшис и соавт. (1999) выявлена их гегерогенность по степени выраженности протеолитической (Prt),
- Київ+380960830922