ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ 3
ГЛАВА 1. Шаперонины их строение и свойства, литературный обзор .12
1.1. Строение шаперонинов группы I 13
1.2. Строение шаперонинов группы 11 20
ЬЗСвойства шаперонинов группы II 25
1.4. Шаперонин бактериофага ЕЬ Р. Aeroginosa 28
ГЛАВА II. Обзор теории малоуглового упругого рассеяния 29
2.1. Однократное рассеяние на частице с однородной плотностью,
дифракция Фраунгофера и первое борцовское приближение 29
2.2. Некоторые известные малоугловые формфакторы тел вращения 34
2.3. Прямая и обратная задачи рассеяния, преобразование Фурье., 35
2.4. Теорема Котелышкова-Шеннона
2.5. Понятие корректной и некорректной задачи 40
2.6. Регуляризованный метода наименьших квадратов (РМНК) 41
2.7 Расчет инвариантов из кривой малоуглового рассеяния 46
2.8 Формула Дебая для прямой задачи малоуглового рассеяния 48
2.9. Решение обратной задачи рассеяния путём моделирования в «прямом
пространстве» 49
2.10. Решение обратная задача рассеяния «методом отжига» 51
ГЛАВА III. Первичная обработка экспериментальных данных - решение
задачи редукции к идеальному прибору, литературный обзор..,. 54
3.1. Источники излучения и система коллимации 54
3.2. Оценка погрешности по оси модуля вектора рассеяния 58
3.3. Введение коллимационных поправок 59
ГЛАВА IV. Вычисление формфактора тора и его приложение к решению
обратной задаче рассеяния шаперонинов 63
4.1. Расчет интенсивности МУР для эллиптического тора 63
4.1.1 Точное выражение для формфактора тора 63
4.1.2. Приближённое выражение для формфактора тора 65
4.2. Асимптотики: область Гинье и область Порода для формфактора тора..68
4.3 Обобщение формфактора эллиптического тора на формфактор двойного эллиптического тора...................................................70
4.4. Прямая задача малоуглового рассеяния для частицы в форме тора, а также восстановление формы частицы по неполным данным.................72
4.5. Решение обратной задачи рассеяния для тора «методом отжига»......73
4.6. Восстановление формы модели молекулы белка шаперонина GroEL....76 ГЛАВА V. Экспериментальная часть, получение и обработка
экспериментальных данных..............................................78
5.1 Методика выделения и растворов белков шаперонинов.................78
5.2. Проверка раствора белка на монодисперсность......................78
5.3. Проведение малоуглового эксперимента на растворе белков..........80
5.4. Обработка экспериментальных данных, от растворов белков шаперонина GroEL и продукта гена 146 (gpl46).....................................83
5.5. Математическое моделирование.....................................89
5.5.1. Восстановление формы шаперонина GroEL методом оболочек 89
5.5.2. Поиск наилучших параметров модели двойного эллиптического тора и полого цилиндра описывающих экспериментальные кривые рассеяния от растворов фагового (gpl46) и бактериального (GroEL) шаперонинов 91
5.6. Поиск различных конформаций вирусного шаперонина в растворе 97
Выводы..............................................................102
Список работ автора по теме диссртации...............................103
Список литературы....................................................104
2
ВЕЕДЕНИЕ.
Малоугловое рассеяние — упругое рассеяние электромагнитного излучения или пучка частиц (нейтронов, электронов) на неоднородностях вещества, размеры которых существенно превышают длину волны излучения (или дебройлевскую длину волны частиц); направления рассеянных лучей при этом лишь незначительно (на малые углы) отклоняются от направления падающего луча. В структурных исследованиях вещества используют, как правило, рентгеновское излучение или тепловые нейтроны с длиной волны —1-10 А (Ю'Мнм). С их помощью изучают неоднородности коллоидных размеров (10-104 А). В отличие от других дифракционных методов с помощью малоуглового рассеяния исследуют структуру разупорядоченных объектов. С помощью МУР изучают строение биологических молекул в растворе, объёмные дефекты в кристаллических веществах, кластерную структуру жидкостей и аморфных тел, поры в различных пористых материалах [ФЭ, т.З, с.41, 1992;], а также можно получить ценную информацию об изменениях ряда параметров структуры при деформации и разрушении. К этим параметрам, в частности относятся размер, форма ориентация и концентрация рассеивающих частиц, распределение частиц по размерам. Значение МУР особенно велико для исследования биологических объектов, например белков, нуклеиновых кислот, вирусов. Метод МУР позволяет изучать структуру нативных биополимеров в физиологических растворах, где образец представляет собой раствор идентичных частиц (монодисперсную систему), а экспериментальная интенсивность рассеяния пропорциональна произведению концентрации частиц в растворе и интенсивности рассеяния одной частицей. Интерпретация экспериментальных данных в этом случае заключается в создании модели низкого разрешения рассеивающей частицы. В данном случае это модель трёхмерной формы частицы в однородном приближении. Построение такой модели осложняется потерей информации при сферическом усреднении - в
3
<
X
отличие от рентгеноструктурного анализа монокристаллов. Поэтому оптимальное использование информации заключенной в экспериментальных данных, а также привлечение дополнительных характеристик, например наличие оси симметрии у частицы, её вытянутости или сплюснутости, оказывается важным при обработке экспериментальных данных. Несмотря на заметный прогресс в области компьютерного моделирования для обработки данных малоуглового эксперимента, описание формы тела минимально возможным набором параметров и дальнейшим поиском этих параметров представляет собой довольно сложную задачу. При этом число используемых формфакторов для описания форм частиц ограничивается классическими работами середины прошлого века Гинье (Сшшег) и Порода (Рого<1) [Рогоб 1948]. Сводная таблица формфакторов представлена также в работах [Бекренёв, Миркин, 1991] и [Свергун, Фейгин, 1986].
Физико-механические свойства таких дисперсных систем, как стёкла, полимеры, керамика и т.п., определяются размерами, формой и взаимным расположением частиц, которые образуют так называемую надмолекулярную структуру. По изменению дифракционной картины под малыми углами можно судить об эволюции надмолекулярной структуры.
Актуальность темы
Определение формы и структурных параметров белковых макромолекул, находящихся в условиях, близких к естественным, представляет собой чрезвычайно важную задачу в исследовании связей структура-свойство таких объектов, так как многие функции белков и их комплексов зависят от их конформации. Метод малоуглового рассеяния рентгеновских лучей (МУР) и тепловых нейтронов в этом случае предоставляет уникальную возможность изучать структуру биологических наночастиц в растворе при размерах, существенно превышающих возможности ядерного магнитного резонанса и при этом не требует какой-либо специальной подготовки образцов, которая часто требуется в других методах исследования. С другой стороны, развитые в последнее время методы интерпретации данных малоуглового рассеяния в
состоянии эффективно учитывать разнообразную априорную информацию о структуре наночастиц, что может существенно повышать надежность получаемых результатов. Особенно актуальным метод малоуглового рассеяния оказываются в случае изучения новых белковых объектов, когда они имеют большие размеры, а получение монокристаллов затруднительно или невозможно. Однако, задача определения трехмерной формы частиц по одномерным данным рассеяния оказывается плохо обусловленной и преодолеть неустойчивость определения структурных характеристик можно с помощью построения моделей формы, описываемых небольшим числом параметров. Этим определяется высокая актуальность теоретической части работы в данном направлении.
В данной работе для параметризации задачи рассеяния от белка бактериального шаперанина вгоЕЬ [Марченков и др., 2006] и вирусного (фагового) шаперонина продукта гена 146 ^146), выведены формфакторы моделей частиц в виде двойного симметричного и несимметричного эллиптических торов, как функции их геометрических параметров и модуля вектора рассеяния. Полученные выражения применены для определения по данным МУР параметров формы белковых комплексов шаперонинов, один из которых изучен впервые. Таким образом, актуальность экспериментальной части работы определяется не только решением задачи оптимальной параметризации предполагаемой формы макромолекулы и сопоставлении полученных различными способами структурных моделей, но и исследованием новых белковых объектов.
Основные цели н задачи работы.
Получить в аналитическом виде формфакторы эллиптических одиночного и двойного симметричного и несимметричного тора, как функцию параметров формы и модуля вектора рассеяния.
Провести моделирование формы молекул белков шаперонинов с известной структурой по полученным экспериментальным данным малоуглового рассеяния, с применением полученных выражений для формфакторов и
5
другими известными программами определения формы. Сравнить модели, полученные этими методами между собой.
Получить экспериментальные данные малоуглового рассеяния от растворов белка вирусного шаперонина pgl46 и найти параметры модели формы молекулы с помощью полученных аналитических выражений формфакторов и традиционных методов моделирования.
Получить экспериментальные данные рассеяния для растворов белка gpl46 в присутствии А'ГФ и с помощью разработанных подходов определить изменения параметров формы молекулы белка при АТФ-зависимом конформационном переходе.
Научная новизна
Впервые методом малоуглового рентгеновского рассеяния проведен анализ конформаций формы макромолекул в растворе имеющих центрально симметричное отверстие путем определения геометрических параметров модели в виде однородного двойного эллиптического тора. Объектами исследования были макромолекулы вирусных и бактериальных шаперонинов, формы которых можно описать формфаторами одиночного и двойного эллиптических торов. А именно, были определены геометрические параметры следующих макромолекул:
1. Хорошо изученный бактериальный шаперонин GroEL;
2. Малоизученный вирусный (фаговый) шаперонин, кодируемый геном 146 (gene product, gpl46) бактериофага EL Pseudomonas aeruginosa [Filchikov M.V, 2009]; С этой целью одной из подзадач данной работы явилось возможность показать для простейшей двусвязной поверхности вращения -тора устойчивое восстановление формы трёхмерного однородного тела заданного внутри своего объёма единичным потенциалом, по пространственно усреднённой кривой малоуглового рассеяния.
Поскольку все шаперонины являются АТФ-азами, использующими энергию, получаемую при связывании и гидролизе АТФ, то для определения конформационных перестроек малоугловым методом впервые определялись
6
параметры изменения формы шаперонина от состава буфера, как параметрическое описание формы частицы через кривую интенсивности малоуглового рассеяния.
Практическая значимость.
Используя метод малоуглового рентгеновского рассеяния была получена пространственная модель малоизученного вирусного шаперонина §р146. С целью ускорения компьютерной обработки экспериментальных данных для бактериальных и вирусных шаперонинов на основе полученных автором тороидальных формфакторов была написана компьютерная программа, существенно ускоряющая поиск формы белков шаперонинов не прибегая к методу случайного перебора конфигураций частицы. Разработанный подход расширяет банк методов анализа систем содержащих наночастицы, имеющие центрально-симметричное отверстие.
На основе малоугловых экспериментальных данных был обнаружен АТФ -зависимый коиформационный переход шаперонина §р146 из закрытого в более функционально активное - открытое состояние.
Структура диссертации.
Диссертация состоит из введения, пяти глав, выводов и списка
литературы. Объём диссертации составляет 115 страницы, включая 40 рисунков, 6 таблиц и более 100 формул. Диссертационная работа состоит из введения, 5 глав и выводов.
Во введении обоснована актуальность темы диссертации, сформулированы цель и основные задачи исследования, обозначены научная новизна и практическая значимость работы.
Первая глава представляет собой литературный обзор о макромолекулах шаперонинах первой (бактериальные шаперонины) и второй (вирусные шаперонины) группы, описано их строение и свойства. В частности проанализированы различные варианты присоединения к бактериальному шаперонину СгоЕЬ своего ко-фактора СгоЕБ. А также описывается, как вгоБЬ взаимодействует с денатурированными белками и
7
белками находящимися в промежуточным конформационным состоянием типа "расплавленная глобула". Сделан обширный обзор теоретических и экспериментальных работ по АТФ функционирования ОгоЕЬ, как молекулярного шаперона. Отмечается, что существенным отличием шаперонинов второй группы является отсутствие у них ко-фактора. Обсуждаются условия АТФ -зависимого конформационного перехода из «открытого» состояния в «закрытое» для шаперонинов II группы, которые до настоящего времени мало изучены.
Вторая глава представляет собой обзор теории малоуглового упругого рассеяния. В ней представлены основные формулы обработки кривых малоуглового рассеяния, а также показано, что в основе методов обработки кривых рассеяния от системы типа "разбавленных раствора" лежит первое борновское приближение. Исходя из этого приближения вычисляются максимальный размер частицы и её радиус инерции. Вычисление максимального размера частицы осуществляется через преобразование Фурье, здесь же приводится теорема Котельникова - Шеннона и подробно описывается регуляризованный (по Тихонову) метод наименьших квадратов лежащий в основе численной реализации преобразования Фурье кривой малоуглового рассеяния. Далее представлена таблица известных формфакторов для однородных частиц, имеющих форму тел вращения.
Третья глава посвящена первичной обработке данных малоуглового эксперимента. В ней описываются различные источники рентгеновского излучения и система коллимации падающего на образец излучения для малоугловой схемы, а также указываются оценки погрешностей экспериментальных данных и необходимость ввода поправок на геометрические размеры падающего на образец рентгеновского луча.
В четвёртой главе автором представлен вывод аналитических выражений для формфатора эллиптического тора. Получено приближенное выражение для формфактора тора, позволяющее сделать проверку закона Гинье и получить асимптотику Порода. Далее, используя комплекс
8
- Київ+380960830922