2
ОГЛАВЛЕНИЕ
1. Введение..............................................................6
2. Обзор литературы.....................................................11
2.1. Определение болезни АЭК..........................................11
2.2. Этиология АЭК....................................................11
2.3. Морфология и химический состав ВАЖ...............................11
2.4. Патогенез артрита-энцефалита коз.................................14
2.5. Методы диагностики...............................................16
2.5.1. Клинические признаки АЭК.....................................17
2.5.2. Патоморфологические изменения................................19
2.5.3. Распространение и пути передачи лентивирусов мелких жвачных. ...20
2.5.4. Диагностическое значение геномной и антигенной вариабельности лентивирусов мелких жвачных и их филогенетический анализ........21
2.5.5. Пермиссивность клеточных культур и изоляция ВАЖ..............23
2.5.6. Серологическая диагностика...................................26
2.5.7. Электронная микроскопия ВАЖ..................................29
2.5.8. Экспериментальная инфекция АЭК...............................29
2.5.9. Полимеразная цепная реакция..................................30
2.5.10. Дифференциальная диагностика................................31
2.5.11. Профилактика и меры борьбы..................................32
2.6. Заключение по обзору литературы..................................34
3. Собственные исследования.............................................36
3.1. Материалы........................................................36
3.1.1. Вирусы и вируссодержащий материал............................36
3.1.2. Животные.....................................................36
3.1.3. Сыворотки....................................................36
3.1.4. Полевой материал.............................................37
3.1.5. Антигенные препараты.........................................37
3.1.6. Культуры клеток..............................................37
3.1.7. Питательные среды и сыворотки................................38
3.1.8. Реактивы и оборудование, используемые в работе...............38
3.2. Методы...........................................................40
3.2.1. Получение культуры клеток СМК................................40
3.2.2. Культивирование клеток СМК...................................40
3.2.3. Криоконсервация клеток СМК...................................41
3.2.4. Определение концентрации и жизнеспособности клеток СМК. 41
3.2.5. Культивирование ВАЖ..........................................42
3.2.6. Культивирование вируса Висны овец (штамм К-796)..............42
3.2.7. Изоляция полевого ВАЖ в культурах клеток.....................43
3.2.8. Определение инфекционной активности ВАЖ и вируса Висны овец.43
3.2.9. Получение сывороток..........................................44
3.2.10. Получение специфических и контрольных антигенов.............44
3.2.11. Постановка реакции диффузионной преципитации................44
3.2.12. Электрофоретический анализ препаратов.......................45
3.2.13. Экспериментальное воспроизведение инфекции..................46
3.2.14. Выделение нуклеиновых кислот................................46
3.2.15. Полимеразная цепная реакция.................................46
3.3. Результаты собственных исследований..............................47
3.3.1. Оценка ростовых свойств, переживания клеток, способности субкультивирования СМК..........................................47
3.3.2. Определение пермиссивности культур клеток к ВАЖ и выделение вируса из организма животных- вирусоносителей...................56
3
3.3.3. Сравнительное изучение биологических свойств изолята «Тверской»
и штамма 750-63 ВАЖ в культуре клеток..............................62
3.3.4. Изучение устойчивости ВАЖ к температурным воздействиям 68
3.3.5. Определение чувствительности перевиваемой культуры клеток ПЯ к вирусу Висны (Исландский штамм К 796)........................69
3.3.6. Изучение течения болезни и патологоанатомических изменений АЭК у животных, заразившихся в естественных условиях...............69
3.3.7. Определение чувствительности козлят к штамму 75-063 ВАЖ 73
3.3.8. Выявление фрагментов генома ВАЖ с помощью ПЦР...............74
3.3.9. Получение культурального специфического антигена............77
3.3.10. Реакция диффузионной преципитации в агарозном геле с использованием специфического антигена ВАЖ для выявления антител к данному вирусу в сыворотках крови коз..........................80
3.3.11. Серологическое обследование поголовья в районах с развитым козоводством...................................................87
4. Обсуждение..........................................................89
5. Выводы..............................................................96
6. Практические предложения............................................97
7. Список литературы...................................................99
8. Приложения.........................................................117
и
2. Обзор литературы
2.1. Определение болезни АЭК
Артрит-энцефалит коз - это болезнь, известная также как лейкоэнцефаломиелит-артрит коз [21; 26], характеризующаяся
симптомокомплексом с развитием демиелинизирующего энцефалита, прогрессирующего артрита, интерстициальной пневмонии и
интралобулярных маститов.
2.2. Этиология АЭК
Первыми о болезни с подобной симптоматической картиной у домашних коз сообщили D. Stavrou с соавторами в 1969 году [119], а предположение о вирусной природе болезни сделал Cork и др. [71]. С помощью бесклеточиой суспензии, приготовленной из органов случайно заболевших животных, им удалось экспериментально воспроизвести болезнь на козах и выделить вирус, имевший при электронно-микроскопическом исследовании морфологические сходства с вирусом висна-маеди овец (ВВМО). Сравнение антигенного состава вирусов АЭК и ВВМО показало наличие у названных возбудителей перекрестно реагирующих мажорных структурных протеинов [6].
В дальнейшем были получены экспериментальные доказательства того, что возбудителем АЭК является ретровирус, по многим свойствам сходный с ВВМО [2; 29; 130].
2.3. Морфология и химический состав ВАЖ
Вирус содержит 60-70S РНК и РНК-зависимую ДНК-полимеразу [143J, а в инфицированных вирусом культурах клеток обнаруживают вирусные частицы, морфологически характерные для ретровирусов. В градиенте сахарозы его плотность составляет 1,15 г/см3, т.е. идентична плотности ВВМО.
12
Морфогенез ВАЭК идентичен морфогенезу ВВМО: частицы типа С ретровируса диаметром 100-120 нм почкуются на плазменных мембранах инфицированных клеток. Эти частицы содержат электронно-плотную внутреннюю структуру, имеющую форму полумесяца. После созревания частицы отпочковываются в межклеточное пространство; зрелые экстрацеллюлярные вирионы имеют отчетливый промежуточный слой, электронно-плотное центрально расположенное ядро. На поверхности сферических вирусных частиц, имеющих цилиндрическую сердцевину, находятся мажорный структурный протеин (р28), поверхностный (§р135) и трансмембранный ^р 40-45) гликопротеины. Поверхностный гликопротеин образует шипы, ими вирус прикрепляется к чувствительным клеткам (рис. 1).
Рис. 1. Структура вириона лентивирусов (по Б.Ф. Шуляку)
НП-нуклеокапсидный протеин; МСП-мажорный структурный протеин; МП-матриксный протеин; ОТ-обратная транскриптаза; ТМ-трансмембранный гликопртеин; ПГ-поверхностный гликопротеин
- Київ+380960830922