2
ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ............................................................... 4
1. Обзор литературы................................................... 10
1.1. Общие сведения о туберкулёзе..................................... 10
1.1.1. Источники и пути передачи микобактерий......................... 12
1.2. Диагностика туберкулёза сельскохозяйственных животных............ 13
1.2.1. Аллергический метод............................................ 13
1.2.2. Патолого-анатомичсский метод................................... 15
1.2.3. Бактериологическое исследование................................ 16
1.2.4. Биологический метод (биопроба)................................. 18
1.3. Методы молекулярной биологии и их использование в диагностике туберкулёза........................................................... 18
1.3.1. Полимеразная цепная реакция. Подбор праймеров.................. 19
1.3.2. Штаммовое типирование микобактерий............................. 21
1.3.3. Секвенирование................................................. 23
1.3.4. Филогенетический анализ........................................ 25
1.4. Особенности молекулярного строения и функционирования микобактерий.......................................................... 28
1.4.1. Генетический полиморфизм....................................... 30
1.4.2. Мобильные элементы генома микобактерий......................... 30
1.4.2.1. Инсерции М. paratuberculosis, М. avium и М. intracellulare: IS900, IS901, IS1141......................................................... 31
1.4.2.2. Инсерции М. tuberculosis complex: IS6110, IS 1081 и новая IS-подобная последовательность........................................... 33
1.4.2.3. Инсерции М. smegmatis: IS6120, IS 1096 и IS1137.............. 35
1.5. Заключение по обзору литературы.................................. 36
2. Собственные исследования........................................... 38
2.1. Материалы и методы............................................... 38
2.2. Результаты исследований.......................................... 41
2.2.1. Анализ эпизоотической ситуации по туберкулёзу в хозяйствах
3
Новосибирской области (2000-2007 гг)......................... 41
2.2.2. Микробиологическая характеристика исследуемой выборки изолятов микобактерий............................................ 42
2.2.3. Подбор и тестирование праймеров для постановки Г1ЦР.
Параметры ПЦР.................................................... 44
2.2.3.1. Специфичность и чувствительность ПЦР для выявления ДПК микобактерий..................................................... 45
2.2.3.2. Тестирование при помощи ПЦР референтных штаммов микобактерий..................................................... 47
2.2.3.3. Тестирование при помощи ПЦР изолятов микобактерий....... 48
2.2.4. Генотипирование обнаруженных микобактерий................. 49
2.3. Определение нуклеотидной последовательности................. 49
2.3.1. Генотипирование изолятов М. arupense и М. terrae.......... 54
2.3.2. Генотипичекое разнообразие М. avium....................... 61
2.3.3. Полиморфизм mig-гена М. avium............................. 67
2.3.4. Генотипирование М. smegmatis.............................. 70
2.3.5. Генетическая характеристика изолята М. tuberculosis....... 73
2.3.6. Индикация и идентификация атипичных микобактерий у грызунов 75
3. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЙ........................... 80
4. ВЫВОДЫ........................................................ 87
5. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ...................................... 89
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ................................................ 90
ПРИЛОЖЕНИЯ....................................................... ПО
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Общие сведения о туберкулёзе и его возбудителях
Туберкулёз является одной из основных инфекций с высоким уровнем заболеваемости и смертности. Этиологический агент данной инфекции — микобактерии, каждый вид которых имеет комплекс культуральных, биологических и биохимических особенностей, позволяющих дифференцировать их друг от друга. Основными возбудителями заболевания являются М. tuberculosis - человеческий вид (D.F. Moore et al, 1995; J. Magdalena ct al., 1998), M. bovis - бычий вид (О. Cosivi et al., 1998; N.P. Shah et al, 2006), M. avium — птичий вид (M.T.Bono et al, 1995), M. paratuberculosis, вызывающий паратуберкулёзный энтерит или болезнь Крона (Ю.Я. Кассич, 1990; J.J. McFadden et al, 1987; R.J. Chiodini, 1989; Sechi L.A., 2005) и M. africanum - промежуточный вид между M. tuberculosis и М. bovis, чаще всего-встречающийся в Южной Африке. Известны более 40 видов атипичных микобактерий, вызывающих у ослабленных животных заболевания, сходные с туберкулёзом - микобактериозы (А.И.Каграманов, 1964; Ю. Я. Кассич, 1990; А.С. Донченко и др., 2004; Е. Wolinsky, 1979).
Туберкулёз у больного животного протекает очень медленно. Более раннему проявлению клинических признаков у больного туберкулёзом животного способствуют роды, охлаждение организма, транспортировка, перемена корма, усиленная эксплуатация, остропротекающие болезни. Туберкулёзный процесс может развиться в любом органе и сопровождается симптоматикой общего характера, непосредственно не зависящей от локализации поражённого органа: лихорадка, недомогание и кахексия, вероятно, опосредованные действием цитокинов (Б. Блум, 2002).
С усовершенствованием методов выделения культур микобактерий и углублением знаний о них участились случаи выделения атипичных микобактерий от человека и животных. Так, классификация, предложенная ' Раньоном (1959) . и основанная на скорости роста, способности к пигментообразованию и морфологии колоний включает в себя 4 группы.
11
Группа I - фотохромогенные, кислотоустойчивые палочки, образующие на свету лимонно-жёлтый пигмент, переходящий в оранжевый или кирпично-красный. Растут при 37°С в течение двух недель на твёрдых средах и при 25 °С в течение трёх недель (чаще 11-формы). Патогенны для мышей при внутривенном заражении. Типичный представитель - М. капвэди.
Группа II - скотохромогенные, кислотоустойчивые микобактерии, образующие оранжевый пигмент на свету и в темноте. Медленно растут при комнатной температуре, быстрее - при 37 °С, колонии обычно 8-формы. Для лабораторных животных практически не патогенны. Типичный представитель-М. зсгоИйасеит.
Группа III - нефотохромогенные, иногда имеющие желтоватый цвет палочки, растущие 3—4 недели при 37 - 45 °С и более медленно при 25 °С. Колонии обычно 8-формы. В рассматриваемую группу входит широкий круг микобактерий, объединённых в комплекс аушт-пигасе11и1аге.
Группа IV - быстрорастущие (3-6 дней) при комнатной температуре микобактерии, колонии беспигментные. Типичные представители - М. АэгШйшп, М. рЫец М. таппшп, М. зп^таЙБ.
А.И. Каграманов (1964) предложил следующую классификацию атипичных микобактерий, где в основу взяты не случайные, второстепенные признаки (пигментообразование, быстрота роста, внешний вид колоний), а их основное свойство — проявление патогенности.
Группа I - атипичные микобактерии, имеющие несомненное генетическое родство с типичными микобактериями туберкулёза.
Группа II - атипичные микобактерии, где такое родство не доказано, но возможно на основании некоторых признаков.
Группа III - атипичные микобактерии нетуберкулёзные, но с различными проявлениями патогенности (нетуберкулёзного характера).
Группа IV - атипичные микобактерии, заведомо сапрофитные.
- Київ+380960830922