Разработка технологии производства набора реагентов для выявления антител к вирусу трансмиссивного гастроэнтерита свиней иммуноферментным методом

СОДЕРЖАНИЕ
1. ВВЕДЕНИЕ............................................... 5
2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ......................................... 10
«
2.1. Трансмиссивный гастроэнтерит свиней (ТГС):
общая характеристика болезни.............................. 10
2.2. Биологические особенности вируса ТГС................;... 14
2.3. Особенности иммунитета при ТГС........................... 21
2.4. Методы лабораторной диагностики и средства
специфической профилактики ТГС............................ 25
СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ....................................... 38
3.1. Вирусный антиген......................................... 38
3.2. Моноклональные антитела.................................. 39
3.3. Испытуемые пробы биологического материала................ 39
3.4. Получение конъюгата МкА 6С7 с пероксидазой хрена......... 39
3.5. Методы иммунофермеитного анализа......................... 40
3.6. Реакция нейтрализации вируса............/................. 42
3.7. Коммерческие ИФА-наборы.................................. 42
3.8. Электрофорез в ПААГ-ДСН.................................. 43
3.9. Иммуноблоттинг........................................... 44
3.10. Статистическая обработка результатов..................... 45
4. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.................................. 46
4.1. Разработка непрямого варианта твердофазного ИФА на основе
моноклональных антител для выявления антител к вирусу трансмиссивного гастроэнтерита свиней...................... ^
4.1.1. Получение и характеристика иммунологических реагентов, предназначенных для использования в ИФА........ 47
4.1.2. Разработка иммуноферментной тест-системы для выявления антител к вирусу ТГС............................ 56
А 4.1.3. Оценка диагностических параметров разработанной
иммуноферментной тест-системы............................. 66
4.1.3.1. Определение антител к вирусу ТГС в
сыворотке крови животных................................ 67
2
4.1.3.2. Определение антител к вирусу ТГС в молозиве иммунных свиноматок................................... 70
4.1.3.3. Оценка возможности тест-системы дифференцировать антитела к вирусу ТГС от антител к РКВС............... 73
' 4.2. Разработка технологии изготовления ИФА-набора для
выявления антител к вирусу трансмиссивного гастроэнтерита свиней «ТГС-СЕРОТЕСТ».................. ^5
4.2.1. Определение стабильности специфических
компонентов ИФА-набора при хранении................... 76
4.2.2. Разработка оптимальной комплектации ИФА-набора
и инструкции по его применению........................ 78
4.2.3. Применение ИФА-набора «ТГС-СЕРОТЕСТ» в практических условиях................................. 83
4.2.4. Контроль воспроизводимости результатов, полученных с помощью ИФА - набора «ТГС-СЕРОТЕСТ»................... 88
5. ОБСУЖДЕНИЕ............................................ 91
6. ВЫВОДЫ................................................ 99
7. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ............................. 101
8. СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ..................... 102
9. ПРИЛОЖЕНИЕ........................................... 121
\
«
3
странением РКВС значительно сократилась циркуляция вируса ТГС и вспышки заболевания в европейских странах. Но в тоже время, в США при циркуляции в популяции свиней аналогичного вируса, проблема специфической профилактики ТГС не потеряла своей актуальности (Saif L.J., Wesley R.D., 1999; Halbur Р. et al., 1994). Подобная ситуация сохраняется и в России. Европейский и Американский штаммы РКВС оказались природными деле-ционными мутантами вируса ТГС, которые утратили свою вирулентность и приобрели пневмотропность (Laude H. et al., 1993; O’Toole D. et al., 1989; Sanchez C.M. et al., 1992.).
2.1.1.Этиология и патогенез
Источником возбудителя инфекции являются больные и переболевшие свиньи, выделяющие вирус ТГС с фекалиями и носовыми секретами. Здоровые животные заражаются перорально и аэрогенным путями. С фекалиями вирус выделяется более 2 недель, с носовой слизью до 11-го дня после заражения, с молоком не менее 5 дней.
Резервуаром вируса являются переболевшие свиньи, у которых он длительно персистирует. Так, из кишечника вирус может быть выделен до 35 дней, из легких - до 104-120 дней после заражения (Chu R.M. et al., 1982; Saif L.J., 1990; Barman N.N. et al.,1998).
В благополучные по заболеванию хозяйства вирус может быть занесен "механическими переносчиками": собаками, кошками, скворцами и домашними мухами. В переносчиках вирус не размножается и может сохраняться до 2 недель (Lee K.M. et al., 1954; McClurkin A.W., 1970; Cough P.M. et al., 1983).
После проникновения вируса ТГС в организм свиней ороназальным способом, размножение его происходит в основном в эпителиальных клетках тонкого отдела кишечника, покрывающего ворсинки, которые являются пальцевидными выпячиваниями стенки кишечника. Размножение вируса в эпителиальных клетках ворсинок приводит к их разрушению и слущиванию в просвет кишечника; ворсинки сильно атрофируются. Резко нарушается пи-
щеварение и всасывание в первые сутки после заражения и развивается тяжелая дегидратация и диарея. Основной причиной гибели животных, вероятно, является дегидратация, метаболический ацидоз и нарушение сердечной функции вследствие гиперкалиемии (Понд У.Д. и др., 1983; Tizard I.R.,2000; Stokes C.R. et al., 1994).
У зараженных новорожденных поросят атрофия ворсинок более сильная, чем у поросят 3-недельного возраста. Замена разрушенных вирусом эн-тероцитов ворсинок у 3-недельных поросят происходит в 3 раза быстрее, чем у поросят в первые дни жизни. Эпителиальные клетки крипт и регенерирующие клетки ворсинок нечувствительны к вирусу ТГС. Тяжесть заболевания связана с тем, что у новорожденных поросят вирус инфицирует все энтеро-циты ворсинок от их основания до вершины, и поражаются ворсинки на всем протяжении тонкого отдела кишечника. У поросят 3-неделыюго возраста поражаются только отдельные участки тощей и подвздошной кишок, развивается умеренная диарея, и потери воды с фекалиями составляют 50 мл в сутки. У 3-х дневных поросят потери воды с фекалиями достигают 150 мл в сутки. Это связано с тем, что компенсаторное всасывание толстого отдела кишечника у 3-дневных поросят не функционирует (Moon H.W., Hooper В.Е. et al., 1969; Moon H.W. et al., 1973, 1978, 1994; Nitte K.H. et al., 1976; Shepherd R.W. et al., 1979; SaifL.J., 1998).
Нарушения кормления (недостаток железа и цинка) и содержание поросят при пониженной или резко меняющейся температуре окружающей среды отягощает течение болезни (Хаитов P.M. и др., 1997; Saif L.J., 1998; Matisheck Р. et al., 1982; Furuuchi S. et al., 1976).
Вирулентный вирус ТГС размножается в легких поросят без проявления клинических признаков болезни. Кроме того, размножение вируса происходит в молочных железах свиноматок и с молоком он быстро распространяется среди поросят-сосунов (Касюк И.И. и др., 1984; Saif L.J., 1990; Bachmann P.A. et al., 1972; Kaji T. et al., 1978; Kemeny LJ. et al., 1975).
12