4
6
10
10
13
16
18
20
24
25
25
28
29
36
41
41
43
43
47
48
51
51
52
54
56
60
60
2
СОДЕРЖАНИЕ
Список сокращений.........................................
1. Введение..................................................
2. Обзор литературы...............................................
2.1. Бактериальные токсины и их классификация..................
2.1.1. Энтеротоксины семейства Еп1егоЬас1епасеае в свете
современной классификации.................................
2.1.2 Распространение в природе...................................
2.1.3. ЬТ-энтеротоксины..........................................
2.1.4. БТ-энтеротоксины..........................................
2.1.5. Шига-токсины..............................................
2.2. Строение генов токсинообразования.........................
2.2.1. Строение генов ЬТ.........................................
2.2.2. Строение генов БТ.........................................
2.2.3. Регуляция синтеза токсинов на генном уровне................
2.3. Факторы адгезии..............................................
2.4. Локализация генов токсинообразования в геноме бактерий.
2.4.1. Хромосомная локализация генов токсинообразования...........
2.4.2. Внехромосомная локализация генов токсинообразования.......
2.4.2.1. Плазмиды.................................................
2.4.2.2. Транспозоны..............................................
2.4.2.3. Бактериофаги.............................................
2.5. Генетический обмен........................................
2.5.1. Роль внехромосомных элементов в формировании токсического фенотипа и распространении токсикоинфекций................
2.5.2. Трансформация.............................................
2.5.3 Конъюгация....................................................
2.5.4. Трансдукция...............................................
3. Материалы и методы........................................
3.1. Штаммы бактерий и бактериофагов
60
61
62
62
63
63
64
64
66
66
67
68
69
70
70
71
75
78
81
83
90
93
97
104
105
106
3
Используемые реактивы и среды.............................
Буферные растворы и среды.................................
Выделение плазмид с помощью щелочного лизиса..............
Выделение высокомолекулярной плазмидной ДНК...............
Выделение ДНК модифицированным методом Экхарда............
Проведение расщепления ДНК рестршсгазами..................
Электрофорез ДНК..........................................
Трансфекция..............................................
Транспозиция.............................................
Получение препаратов фагаМ 13.............................
Определение титра бактериофагов...........................
Конъюгация...............................................
Спот-тест................................................
Экспериментальная часть.................................
Определение оптимальных условий выделения плазмидной
ДНК......................................................
Анализ плазмидных профилей изучаемых штаммов.... Анализ обнаруженных плазмид на наличие генов
токсинообразования.......................................
Рестрикционный анализ плазмид, кодирующих
токсинообразование.......................................
Определение молекулярной массы плазмид....................
Определение копийности изучаемых плазмид..................
Изучение влияния дозы гена на уровень продукции токсинов.. Изучение возможности переноса генов токсинообразования
между различными штаммами E. coli.........................
Обсуждение результатов..................................
Выводы...................................................
Практические предложения................................
Список использованной литературы........................
инициируемым субъединицей В (Merrit et al., 1995). Среди токсинов этой группы у представителей семейства Enterobacteriacea обнаруживаются:
а) Шига-токсин у Shigella disenteriae и шига-подобные токсины у энтерогеморрагических E. coli.
б) Термолабильные энтеротоксины энтеротоксигенных E. coli.
в) Цитолетальные токсины Shigella flexneri и E. coli. Эффект действия цитолетальных “вспенивающих” токсинов (cytolethal distending toxins -С DT) на культуру клеток проявляется вспениванием мембраны и фрагментацией ядерного материала клеток с последующим значительным увеличением в размере и гибелью пораженных клеток. Токсины данной группы блокируют фазу G2 клеточного цикла и нарушают клеточный пролиферативный процесс. Наиболее чувствительны к CDT энтеробактерий быстрообновляющиеся клетки кишечных крипт, которые в результате воздействия токсина утрачивают способность к созреванию и диффсрснцировке (Picket et al., 1999).
г) Цитотоксический некротизирующий фактор (CNF) E. coli. Эффект токсического действия CNF заключается в активирующем модифицировании Rho-подсемейства небольших ГТФ-связывающих белков, регулирующих образование цитоскелета. В итоге их воздействие приводит к сокращению волокон актина и последующей складчатости цитоплазматической мембраны клетки-хозяина (Aktories, 1997; Flatau et al.,
1997).
3) Инъекционные токсины, транспортируемые по типу секреции III типа. В настоящее время эти токсины описаны только у грамотрицательных бактерий. Среди них дифференцируют:
а) Токсины, индуцирующие процессы фосфорилирования/ дефосфорилирования. Токсины, влияющие на процесс фосфорилирования тирозина, представлены протеинкиназами YopH и YopO Y.enterocolitica и YpkA Y.pseudotuberculosis и Y.pestis (Hakansson et al., 1996; Perry et al.,
1998). YopH осуществляет ингибирование процесса фагоцитоза у клеток
хозяина, благодаря чему этот токсин рассматривают как наиболее важный фактор патогенности Y. sp. Клеточные мишени для YopO и YpkA не известны, но мутантные по этим белкам бактерии непатогенны (Endo et al.,
1998).
б) Токсины, участвующие в активации/инактивации Rho ГТФаз. К этому разряду токсинов относятся SopE, SptP Salmonella sp. и YopE Yersinia sp. Эти белки через активацию Rho ГТФазы обуславливают перестройку актина и его фрагментацию, в результате чего мембрана клетки-хозяина теряет свою нормальную форму (Robins-Browne et al., 1993; Kaniga et al., 1996).
в) Токсины, транслоцирующие рецептор для интимина (Tir). К токсинам данного разряда относится Tir-протеин энтеротоксигенных штаммов E.coli. Имея два потенциальных трансмембранных домена, этот белок, в условиях внутренней среды организма человека, интегрирует в мембрану энтероцита и выступает в дальнейшем в качестве рецептора для фактора прикрепления интимина E.coli. Фосфорилирование С-терминального участка Tir-протеина, включенного в мембрану, вызывает гранулирование актина, конденсирование его под бактерией с формированием так называемого “пьедестала” (Бондаренко, 1999; Kenny et al., 1997).
г) Инвазины. К этому разряду относят белки IpaA, IpaD и VirA Shigella sp. Экспрессия этих белков коррелирует со способностью этих бактерий к температурозависимой инвазии эпителиоцитов и межклеточному распространению (Buysse et al., 1987).
д) Токсины, индуцирующие метаболизм инозитола. Такие токсины этой найдены у S.dublin, Shigella flexneri и S.typhimurium. Они участвуют в гидролизе нескольких фосфолипидов инозитола Высвобождение фосфатидилинозипголтрифосфата обуславливает секрецию СГ и развитие диареи (Galyov et al., 1997).
- Київ+380960830922