Молекулярно-генетический анализ распространения токсигенной микрофлоры

Содержание
Введение
1. Обзор литературы
1.1. Систематика семейства ЕШегоЬааепассас...................................
1.2. Факторы патогенности и генетический контроль синтеза энтеротоксинов.....
1.3. Классификация и молекулярная организация энтеротоксинов.................
1.4. Механизм действия энтеротоксинов .......................................
1.5. Методы детекции токсигенной микрофлоры .................................
1.5.1. Методы биологического тестирования энтеротоксинов ................
1.5.2. Иммунологические методы детекции энтеротоксинов ..................
1.5.3. ДНК-ДНК гибридизация .............................................
1.5.3.1. Принцип метода гибридизации. Методы гибридизации ...........
1.5.3.2. Гибридизациопные ДНК-зонды .................................
1.5.3.3. Введение метки в нуклеиновые кислоты .......................
1.5.3.4. Способы введения метки в ДНК-зонды .........................
1.5.4. Полимеразная цепная реакция ......................................
1.5.4.1. Принцип метода ПЦР .........................................
1.5.4.2. Этапы полимеразной цепной реакции ..........................
1.5.4.3. Компоненты реакционной смеси ПЦР ...........................
1.5.4.4. Условия проведения ПЦР ...;.................................
1.5.4.5. Детекция результатов ПЦР ...................................
1.5.4.6. Интерпретация результатов ПЦР ..............................
1.5.4.7. Способы повышения чувствительности ПЦР .....................
1.5.4.8. Достоинства метода ПЦР .....................................
1.5.4.9. Практическое применение ПЦР при диагностике токсикоинфекций Собственные исследовании
2. Материалы и методы .......................................................
2.1. Оборудование ...........................................................
2.2. Использованные реактивы ................................................
2.3. Буферные растворы ......................................................
2.4. Штаммы и плазмиды ......................................................
2.5. Питательные среды ......................................................
2.6. Определение биохимических свойств культур ..............................
2.7. Получение биомассы ............................................................................................................
2.8. Выделение плазмидной ДНК ...............................................
2.9. Очистка плазмидной ДНК .................................................
2.10. Электрофорез ДНК ......................................................
2.11. Расщепление плазмидной ДНК эндонуклеазами рестрикции ..................
2.12. Извлечение ДНК из легкоплавкой агарозы ................................
Стр.
3
6
7
9
13
14 14 17 20 21 23 28 32 34 34
36
37 39
41
42
43
47
48
51
51
51
51
52
52
53 53
53
54 54
54
55
56
56
57
58
58
59
59
61
61
63
69
69
69
69
69
71
73
73
73
77
80
84
84
86
89
91
91
92
93
102
116
117
118
138
2.13. Выделение ДНК из агарозных гелей с использованием сорбента ЗДаБзМШс ...
2.14. Генетическая трансформация Е.соН .....................................
2.15. Введение биотиновой метки в препараты ДНК ............................
2.16. ДНК-ДНК гибридизация с биотинилированными зондами ....................
2.17. Детекция результатов гибридизации ....................................
2.18. Полимеразная цепная реакция ..........................................
2.19. Подбор оптимальных условий проведения ПЦР ............................
3. Результаты исследовании ...................;.............................
3.1. Выделение штаммов энтеробактерий, контаминирующих кормосмеси для норок ......................................................................
3.2. Изучение биохимических свойств штаммов и их идентификация .............
3.3. Определение патогенности изолированных штаммов ........................
3.3.1. Биологические методы тестирования ...................................
3.3.1.1. Изучение патогенных свойств подкожным введением ...............
3.3.1.2. Определение наличия токсинообразования ........................
3.3.1.2.1. Определение наличия термостабилыюго токсина БТ ...........
3.3.1.2.2. Определение наличия термолабильного энтеротоксина ЬТ .....
3.3.2. Молекулярно-генетические методы тестирования ........................
3.3.2.1. Конструирование диагностических ДНК-зоидов ....................
3.3.2.1.1. Получение зондов на гены отдельных субъединиц термолабильного токсина ..............................................
3.3.2.1.2. Биотиннлированне зондов и определение включения метки ....
3.3.2.1.3. Получение зонда на полноразмерный ЬТ-оперон ..............
3.3.2.2. Анализ штаммов на наличие генов токсинообразования ............
3.3.2.2.1. Оптимизация условий гибридизации .........................
3.3.2.2.2. Изучение распространения генов токсинообразования методом ДНК-ДНК гибридизации ...................................................................................
3.3.2.2.3. Определение генов шига-подобных токсинов БЬИ и бЬТП методом гибридизации с радиоактивным зондом ............................................................
3.3.2.3. Разработка метода полимеразной цепной реакции для детекции генов токсинообразования у энтеробактерий .....................................
3.3.2.3.1. Анализ первичных последовательностей и подбор праймеров ..
3.3.2.3.2. Оптимизация условий проведения полимеразной цепной реакции
3.3.2.3.3. Изучение распространения генов токсинообразования методом ПЦР ....................................................................................................
4. Обсуждение результатов ..................................................
5. Выводы ..................................................................
6. Сведении о практическом использовании результатов .......................
7. Список литературы .......................................................
8. Приложении ..............................................................
12
Среди LT, продуцируемых штаммами различного происхождения, имеются некоторые различия. Так например, термолабильный токсин штаммов, изолированных от людей (LTh) несколько отличается от токсина штаммов, выделенных от свиней (LTp), но эти различия касаются в основном субъединиц В [Clements et al., 1982; Guth et al., 1986], тогда как субъединицы A у LTh и LTp идентичны. Разновидности LT, продуцируемые и E.coli и V. cholerae, не различаются или почти не различаются по биологическим и иммунологическим свойствам, но обладают теми или иными физико-химическими особенностями.
Термостабильпые эшперопюксипы ST представляют собой низкомолекулярные пептиды (103-1(ГД), которые инактивируются после 30 минутного прогревания при 100°С, сохраняют активность при низких значениях pH и не разрушаются протеолитическими ферментами [Takcda ct al., 1984]. ST-этнеротоксины ЭТКП классифицируется в две главных группы: STI и STII. Последовательность estAl, первоначально изолированная из Е. сой животного происхождения, кодирует STp, a cstA2 (из Е. coli человеческого происхождения) кодирует STh. Гомология между этими аллелями составляет приблизительно 70% [Candrian ct al., 1991]. Никаких биохимических и серологических маркеров для дифференцирования их не существует. Токсины проявляют различную активность на биологических моделях [ Blome'n et al., 1993], а именно: STI (или STa) активны в тесте на новорождённых мышах или морских свинках, STII (или STb) энтеротоксниы не активны на указанной модели, но детектируются тестом лигированной петли кроликов, морских свинок, крыс [Gyllcs, 1979].
В свою очередь представителей класса STI разделяют на 2формы: STIa ( или STp -в штаммах, выделенных при диарее телят, поросят, часто сочетается с адгезином К99) и STIb (или STh -в штаммах, изолированных при диареях у люден) [Echeverria et al., 1985]. По результатам ДНК-ДНК гибридизации STIa и STIb не гомологичны, хотя состоят из 72 аминокислот, 13 из которых являются сигнальной последовательностью при трансмембранном переносе ST, т.к. отличаются друг ог друга аминокислотными заменами. Определение первичной нуклеотидной последовательности генов, кодирующих STII позволило установить, что молекула STII содержит 48 аминокислот, 23 из которых являются сигнальным пептидом, и не содержит участков гомологии с STI.
STI и STII отличаются по механизму действия от LT и являются слабыми антигенами. Установлено, что STI в отличие от LT активизирует гуаннлатциклазу и представляет собой пептид мол. массой 2000Д.
13
1.4. Механизм действия энтеротоксинов
Патогенез диарейных заболеваний, возбудителями которых являются энтеротоксигеиные эшерихии, был изучен на лабораторных животных, а также на добровольцах и подробно описан в литературе [Moon, 1979]. В основе токсического действия бактериальных токсинов лежит нарушение регуляции важных биохимических процессов клетки.
Развитие инфекционного процесса включает 2 основные стадии: колонизацию возбудителем тонкой кишки и продукцию им токсинов. В структурной организации слизистой оболочки кишечника различают 3 слоя: слой кишечных ворсинок, выступающих в просвет кишки, слой слизистой с углублениями (криптами) и мышечный слой. Кишечные ворсинки и слой слизистой покрыты эпителием, имеющим надмембранный покров - гликокапнкс, в состав которого входят гликопротеины и гликолнпнды. Микроорганизмы, попав в просвет тонкой кишки, за счёт подвижности направляются к слизистой. Для прохождения сквозь неё к эпителиальным клеткам, микробами вырабатывается ряд ферментов (протеаз), разрушающих слизь. Помимо активного участия в преодолении защитной системы кишечника, протеазы бактерий путём расщепления активизируют молекулу энтеротоксина, поскольку первоначальная форма токсина в значительной мере лишена биологической активности.
Далее идёт прикрепление энтеротокенгенных эшерихий с помощью адгезинов к гликолису эпителия, потеря подвижности и размножение в этой области (колонизация тонкого кишечника). На следующем этапе синтезированный бактерией токсин секретируется и адсорбируется на клеточной мембране кишечного эпителия, связываясь с рецепторами слизистой оболочки тонкого кишечника, стимулирует активность фермента адснилатцнклазы, что приводит к увеличению уровня внутриклеточного циклического аденозин-3',5'-монофосфата (цЛМФ) [Holmgren et al., 1982; Урбанович и др.,1988]. За счёт этого происходит нарушение секреторного процесса, что приводит к усиленной секреции этими клетками жидкости и развитию диареи [Moss et al., 1978]. При этом у взрослых и детей старшего возраста и молодняка сельскохозяйственных животных могут наблюдаться слабые симптомы диареи, в то время как у новорождённых наблюдается профузиый водянистый понос, быстро приводящий к обезвоживанию и шоку, т.к. новорожденные особо чувствительны к нарушению жидкостного баланса.
Кишечные палочки, продуцирующие эитерогоксины, через 7-10 дней после начала острой диареи исчезают из кишечника человека, однако, в некоторых случаях симптомы могут повторяться в течение нескольких недель. Энтеротоксины проявляют своё действие