2
СОДЕРЖАНИЕ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.........................................................5
ВВЕДЕНИЕ...............
Актуальность проблемы.....................................................6
Цель и задачи исследования................................................7
Научная новизна работы....................................................7
Практическое значение работы..............................................8
Апробация диссертации.....................................................8
Объем и структура диссертации.............................................9
ЧАСТЬ 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ............................................. 10
1. Проблема определения видовой принадлежности мясных ингридиентов 10
2. Молекулярные методы определения видовой принадлежности мясных
ИНГРЕДИЕНТОВ В КОРМАХ................................................... 12
3. Принцип полимеразной цепной реакции...................................14
4. Подбор праймеров......................................................15
4.1. Дизайн праймеров..................................................15
4.2. Температура отжига................................................16
4.3. Длина праймеров...................................................16
4.4. Вырождение праймеры...............................................17
5. Факторы воздействующие на ПЦР.........................................18
5.1. Температура и время денатурации...................................18
5.2. Температура и время элонгации.....................................19
5.3. Реакционный буфер.................................................19
5.4. Количество циклов амплификации....................................20
5.5. «Горячий старт» ПЦР...............................................20
5.6. Контаминация в ПЦР и предложения по обустройству ПЦР-лаборатории 21
5.8. Внутренний контрольный образец (ВКО)..............................23
ЧАСТЬ 2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ........................................25
ГЛАВА 1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ..............................................25
1. Базы данных нуклеотидных последовательностей ДИК и компьютерные программы для обработки этих данных....................................25
2. Образцы-сравнения ДНК.................................................25
2.1. Коммерческие препараты ДНК........................................25
3
2.2. Самостоятельно полученные образцы ДНК из цельной крови животных 26
3. Образцы кукурузной, куриной, рыбной и мясокостной муки...................26
2.1. Отбор образцов.......................................................26
3.2. Приготовление смесей.................................................26
3.3. Перечень видов смесей кормовой муки..................................26
4. Образцы сухого и консервированного корма для животных....................27
5. Образец сыворотки лошадей................................................27
6. Методика выделения ДИК из цельной крови по Maniatis (94).................27
6.1. Выборочный лизис эритроцитов.........................................27
6.2. Обработка лейкоцитарного осадка протеиназой К........................28
6.3. Экстракция ДНК фенол-хлороформом с последующей преципитацией этанолом............................................................. 28
7. Оценка концентрации ДНК спектрофотометрическим методом (94)..............29
8. Методика выделения ДНК сорбцией на селикагеле по Boom (24)...............29
9. Методика проведения реакции амплификации.................................30
9.1. Состав реакционной смеси, условия амплификации.......................30
9.2. «Горячий старт»......................................................30
10. Методика проведения электрофореза в агарозном геле......................31
И. Методика определения говядины в образцах методом ИФА.....................31
ГЛАВА 2. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.......................................... 32
1. Выбор олигонуклеотидных праймеров для дифференциальной амплификации ДНК говядины и баранины..................................................32
2. Изучение специфичности выбранных праймеров...............................32
3. Подбор условий ПЦР.......................................................33
3.1. Оптимизация температуры отжига специфических олигонуклеотидов (праймеров).......................................................... 33
3.2. Подбор концентрации праймеров........................................34
3.3. Применение «горячего старта».........................................35
4. Определение чувствительности и специфичности выбранной системы амплификации.............................................................35
5. Подбор методов выделения (очистки) ДНК из муки...........................36
6. Внутренний контрольный образец (ВКО).....................................38
7. Отрицательные и положительные контрольные образцы........................39
9
Материалы диссертации доложены на 3-Й Всероссийской научно-практической конференции «Генодиагностика в современной медицине» (Москва, 2000 г.); на Всероссийской научной конференции «Совершенствование методов контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов» (Москва, 2001 г.); на международном конгрессе «Биотехнология - состояние и перспективы развития» (Москва, 2002 г.); на 4-й Всероссийской научно-практической конференции «Генодиагностика инфекционных заболеваний» (Москва, 2002 г.); на научнопроблемных методических коммисиях ФГУ ВГНКИ (1999-2003 гг.).
Объем и структура диссертации
Диссертация изложена 104 страницах компьютерного текста, и включает: введение, обзор литературы, материалы и методы исследований, результаты собственных исследований, обсуждение полученных результатов исследований, выводы, практические предложения и указатель литературы (всего 162 источника, в том числе 148 иностранных). Диссертация иллюстрирована 13 рисунками и 9 таблицами. Прилагаются разработанные нормативные и другие документы, подтверждающие результаты исследований, их научно-практическую ценность.
ЧАСТЬ 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1. Проблема определения видовой принадлежности мясных ннгридиентов.
Одной из сложных задач, которую постоянно приходится решать ветеринарной службе, является видовая дифференциация мяса в продуктах питания и кормах, подвергавшихся термической обработке. Необходимость этого очевидна для защиты потребителя от фальсификации мясной продукции по экономическим причинам.
Значимость проблемы в последние годы возросла в связи с открытием новых видов прионных заболеваний (115) сельскохозяйственных и домашних животных, относящихся к группе трансмиссивных губкообразных энцефалопатий таких, как губкообразная энцефалопатия крупного рогатого скота (40), губкообразная энцефалопатия кошек, трансмиссивная энцефалопатия норок, хроническая изнуряющая болезнь оленей и лосей, энцефалопатия экзотических животных (куду, ньяла и др.) (10, 152).
Губкообразная энцефалопатия крупного рогатого скота (ГЭ КРС) впервые диагностирована в Великобритании в ноябре 1986 года (148). К середине 1997 года зарегистрировано 168306 подтвержденных случаев болезни на 67% ферм молочного и 15,8% мясного скота, забито более 1,3 млн. голов КРС. Единичные случаи этой болезни зарегистрированы и в других странах: Ирландии, Швейцарии, Франции, Португалии, Германии, Дании, Италии, Омане, Фолклендских островах, Голландии, Бельгии, Канаде. Обнаружена она также у зоопарковых (более 100 случаев) и домашних животных (у кошек) (2, 10).
По данным международного эпизоотического бюро за 1989-2002 годы в мире зарегистрировано 3611 случаев ГЭ КРС, и более 177 000 случаев в Великобритании. В 2000-2001 годах отмечен рост случаев ГЭ КРС во Франции (134), Ирландии, а в 2001— 2002 годах в Бельгии, Германии, Нидерландах, Испании, Италии, Португалии отмечено от нескольких десятков до сотен случаев в год. В 2003 году в мире зарегистрировано 777 случаев ГЭ КРС и 425 случаев в Великобритании (45, 133).
Вопрос о возможном заражении людей возбудителем ГЭ КРС начал обсуждаться после появления в Великобритании в 1994 году нетипичных случаев болезни Крейтцфельда-Якоба (118, 153). Средний возраст заболевших людей составил 29 лет (19-41 год) и продолжительность болезни - 14 месяцев, в то время как при классическом варианте болезни - 58-65 лет при продолжительности болезни - 6
- Київ+380960830922