СОДЕРЖАНИЕ.
ПРИНЯТЫЕ ОБОЗНАЧЕНИЯ ВВЕДЕНИЕ
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Специфическая профилактика сальмонеллезов сельскохозяйственных животных
1. 2. Производство лиофилизированных бактериальных вакцин
1.2. 1. Факторы, влияющие на выживаемость бактерий при изготовлении лиофилизированных вакцин
1.2. 1. 1. Условия культивирования микроорганизмов
1.2. 1.2. Концентрация бактерии в суспензии
1.2. 1.3. Устойчивость разных видов микроорганизмов к замораживанию-высушиванию
1.2. 1.4. Защитные среды и криопротекторы
1.2. 1.5. Сублимационное высушивание биопрепаратов
2. 1.6. Остаточная влажность препарата
1.2. 1.7. Газовая фаза гфи хранении сухих биопрепаратов и повреждающее действие кислорода
1.2. 1.8. Условия хранения высушенных вакцин
1. 2. 2. Контроль лиофилизированных вакцин
1. 3. Косвенные методы определение количества жизнеспособных микробных клеток
3
стр
1. 4. Определение количества жизнеспособных микробных клеток
биолюминесцентным методом при помощи люциферин-люциферазной системы светляков 35
1.4. 1. Применение люциферазы светляков для решения биоаналитических задач 36
1. 4. 2. Методология биолюминесцентного определения количества микробной биомассы 38
1. 4. 2. 1. Подготовка образцов для определения АТФ 38
1.4.2. 2: Методы экстракции внутриклеточного АТФ 39
1. 4. 2. 3. Применение АТФ-метрии для контроля качества
защитных сред при изготовлении лиофилизированных вакцин 41
ГЛАВА 2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 45
2. 1. Вещества, реагенты и материалы 45
2. 2. Объекты исследования 45
2. 3. Использованная аппаратура 46
2. 4. Методики проведения экспериментов 46
2. 4. 1 Получение лиофилизированной вакцины & {урМтипит 46
2. 4. 1. 1. Приготовление культуры 5*. фрЫтипит 46
2. 4. 1. 2. Приготовление защитной среды 47
8
питательную среду предельных разведений препарата, после чего подсчитывают количество колониеобразующих единиц (КОЕ) до лиофилизации и после.
Метод определения КОЕ является трудоемким, субъективным и требует много времени на выращивание и подсчет колоний. Поэтому при разработке оптимальных условий лиофилизации исследователи, изменяя какой-либо параметр сублимационного высушивания, редко определяют непосредственно выживаемость микроорганизмов после лиофилизации, а чаще измеряют остаточную влажность препарата, которая, как показывают литературные данные, влияет на сохранность живых бактерий в ходе длительного хранения [1, 15, 18, 24, 27].
В настоящее время в биотехнологических производствах все шире используют ускоренные (косвенные) методы определения титра клеток. Эти методы основаны на измерении какого-либо физико-химического параметра образца, абсолютная величина которого или её изменение пропорциональны количеству жизнеспособных клеток в образце. Среди большого разнообразия методов, используемых для этих целей, высокой точностью, воспроизводимостью и эконохмичностью отличаются методы, основанные на определении содержания различных внутриклеточных или внеклеточных метаболитов, в первую очередь, внутриклеточного аденозинтрифосфата (АТФ).
АТФ - универсальный внутриклеточный метаболит, который содержится в относительно высоких концентрациях в клетках любых микро - и макроорганизмов. Его количество с большой точностью можно определить при помощи биолюминесцентного метода даже при ультра малом содержании в образце - до 10'14-ь10'15 моль/кювета люминометра [16].
После гибели клетки содержание АТФ, в отличие от других внутриклеточных метаболитов, резко снижается в течение нескольких
секунд [75]. Поэтому по содержанию внутриклеточного АТФ в анализируемом образце можно определять только жизнеспособные клетки. Это представляет практический интерес для подсчета количества живых микроорганизмов в препарате, подвергнутых значительным стрессовым воздействиям (замораживание-оттаивание, лиофилизация и др.).
В настоящее время процедура биолюминесцентного определения АТФ получила достаточное распространение в разных областях биометрии. Многие фирмы производят коммерчески доступные АТФ-реагенты и приборы для детекции биолюминесценции - люминометры, как портативные, так и стационарные. Их стоимость, по сравнению с большинством оптических приборов, невелика. Все это обусловливает возможность широкого практического использования биолюминесцентного метода в биотехнологических производствах. Следует отметить, что биологические образцы, как правило, помимо микробного (целевого) АТФ содержат соматический и/или внеклеточный АТФ в концентрациях, часто превышающих концентрацию целевого на несколько порядков [57, 92]. Поэтому для правильного определения микробного АТФ необходимо проводить специальную пробоподготовку образца, включающую такие стадии, как концентрирование микробных клеток и/или удаление из образца нецелевого АТФ. Методика пробоподготовки образца зависит от его состава, поэтому для конкретного образца очень важно подобрать и оптимизировать условия её проведения.
Цель наших исследований состояла в изыскании оптимальных параметров лиофилизации 5. /урЫтипит N3 и разработке методики биолюминесцентного определения титра живых бактерий в готовых вакцинах.
- Київ+380960830922