Разработка полимеразной цепной реакции с гнездовыми праймерами для выявления Fusobacterium necrophorum subsp. necrophorum

СОДЕРЖАНИЕ
ВВЕДЕНИЕ..........................................................
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ................................*...............
1.1 Характеристика возбудителя некробактериоэа...................
1.1.1 Морфология Fusobacterium necrophorum......................
1.1.2 Культуральные и биохимические свойства....................
1.1.3 Патогенные свойства F. necrophorum.......................
1.2 Диагностика некробактериоэа..................................
1.3 Схема разработки диагностической тест-системы................
1.3.1 Выделение хромосомной ДНК........................................
1.3.2 Полимеразная цепная реакция. Подбор праймеров.............
1.3.3 Параметры температурных циклов............................
1.4 Заключение по обзору литературы..............................
2 СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ........................................
2.1 Материалы и методы исследования..............................
2.2 Конструирование полимеразной цепной реакции с гнездовыми праймерами для выявления F. necrophorum.........................
2.2.1 Выделение хромосомной ДНК микроорганизмов.................
2.2.2 Выбор праймеров для постановки ПЦР...................
2.2.3 Компоненты ПЦР............................................
2.2.4 Оптимизация режимов постановки ПЦР.................................
2.2.5 Специфичность и чувствительность ПЦР для выявления
F. necrophorum.............................................................
2.2.6 Результаты исследований клинического материала............
3 ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЙ.............................
4 ВЫВОДЫ ......................................................................................
4
10
10
10
12
16
18
27
27
29
31
33
35
35
37
т
U I
45
46
47
53
56
р. 9
W1M
ГЧП,
{ и
ЛИТЕРАТУРА
ПРИЛОЖЕНИЕ
роз РизоЬасіегіші песгорЬогші зиЬзр. пеогорЬогигл биотип АЕ от другой микрофлоры, з том числе от слабопатогєнного биотипа Е и непатогенной РизоЬаоіегішп рзеибопесгорЬогшп. обладающий специфичностью и высокой чувствительностью.
2. Разработан способ генетического типирования штаммов Ризо-ЬасЬегішп пеогорЬогигл биотипа АВ методом ПЦР-ДЦРФ с помощью спе-цифических праймеров и рестрикцией ампликона эндонуклеазой НрзІІ (МзрІ).
Структура и объем работы. Диссертация изложена на 97 страницах, содержит 5 таблиц. 5 рисунков. Состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения результатов исследований, выводов, практических предложений, списка литературы и приложения. Список литературы включает в себя 197 источников, из них 86 иностранных.
Автор выражает благодарность за участие в выполнении некоторых фрагментов работы сотруднику отдела химии природных соединений ГНЦ ВБ "Вектор" В.А. Горбунову, за предоставление референтных штаммов бактерий заведующему лабораторией болезней молодняка ГНУ КЗВСиДВ Н.А. Шкиль и старшему научному сотруднику М.Н. Шадриной.
- 10 -
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1 Характеристика возбудителя некробактериоза
1.1.1 Морфология Fusobacterium necrophorum
Возбудителя некробактерпоза выделил Р. Кох з 1881г., в 1882г. его подробно описал Леффлер. В России первое подробное описание морфологической картины возбудителя некробактериоэа сделал А.Г. Ревнивых (1932). Позднее многие исследователи (В.А. Балабанов, 1971, А.Х. Лайшев, Н.С. Семенов. 1971, В.М. Львов. 1971,
О.И. Соломаха, 1973. А.А. Самоловов, 1998), отмечая трудности работы с F. necrophorum, указывали з первую очередь на полиморфизм
tiiUr.Uw'Ju..
По данным зарубежных авторов, у F. neorophorum различают три основных (А, Б и С) и один промежуточный (AB) биотипы. Биотип А F. necrophorurn subsp. neorophorum чаде выделяют из абсцессов печени крупного рогатого скота. Биотип AB в основном находят а поражениях конечностей ОЕбц и крупного рогатого скота, биотип В F. neorophoruiri зиЬзр. £ und 111 forme постоянно выделяют из содержимого рубца, а также из поражений, первично вызванных биотипа,іи А и АБ. Биотип С выделен в новый вид F. pseudonecrophorum, его можно выявить в содержимом рубца, абсцессов и фекалий. Данная дифференциация основала на фенотипических проявлениях генетической информации, заложенной в гена:-: возбудителя, и заключается в способности некоторых биотипов агглютинировать или лизировать эритраци-ты, синтезировать липазу (D.L. Emery et al., 1985; Т. Shinjo et al., 1990, 1991; A.L.M. Hodgson et al., 1393; O.G.I. Qkwumabua et al., 1996; S. Saginala et al., 1996, 1997). Кроме того, эти биотипы различаются и морфологически. Дяя биотипа А к AB характерны