РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ
У дослідах на нелінійних статевонезрілих самцях білих щурів вивчено динаміку кількісних змін ентероендокринних клітин ЕС-типу, індекс їх насиченості серотоніном, вміст мелатоніну, процеси пероксидного окиснення ліпідів, стан антиоксидантної системи, тканинного фібринолізу, необмеженого протеолізу в дискретних відділах шлунково-кишкового тракту в нормі та за умов гострого гіпоксичного впливу і різного фотоперіоду.
2.1. Піддослідні тварини
Дослідження проведені на 240 самцях статевонезрілих безпородних білих щурів масою 65-75 г, які перебували в досліді 7 діб. Статевонезрілі щурі використані в зв'язку з тим, що з віком зменшується кількість та чутливість рецепторів до мелатоніну і можливість досягнення швидких зсувів гомеостатичних реакцій, які забезпечують адаптацію до фотоперіодичних змін. Тварин утримували на стандартному вітамінізованому харчовому раціоні при температурі 20-24оС з вільним доступом до води [103]. За 9 днів до початку експерименту визначали стійкість тварин до гострої гіпобаричної гіпоксії і використовували надалі лише середньостійких тварин [23].
2.2. Моделювання фотоперіодичних змін у піддослідних тварин
Моделювання змін фотоперіоду проводилось впродовж 7 діб за допомогою трьох режимів освітлення: природного - співвідношення світлової та темнової фаз складало 16/8 год (відповідає весняно-літньому періоду); постійного світла протягом доби; цілодобової темряви. Режим постійного освітлення створювався в установці за допомогою лампи денного світла потужністю 20 Вт, що забезпечувало рівномірне освітлення інтенсивністю 500 лк та зниження рівня циркулюючого мелатоніну у крові не менш, як на 90% [249]. Доступ до тварин, які знаходились в умовах постійної темряви, здійснювався при слабкому червоному світлі (2 лк), що забезпечувало підтримання високого рівня мелатоніну [206].
2.3. Введення досліджуваних речовин
Після моделювання фотоперіодичних змін групі тварин за 30 хв до моделювання гострої гіпоксії вводили мелатонін. Контрольним тваринам вводили еквівалентну кількість розчинника за ідентичних експери-ментальних умов. Мелатонін ("Sigma", США), розведений в 0,1%-ному етанолі, вводили внутрішньоочеревинно в об'ємі 0,3 мл з розрахунку 1мг/кг маси тіла [12]. Зазначена доза, яка перевищує вміст циркулюючого ендогенного мелатоніну, забезпечує підсилення його фізіологічних ефектів у тканинах шлунково-кишкового тракту.
2.4. Моделювання гострої гіпоксичної гіпобаричної гіпоксії
Гостру гіпобаричну гіпоксичну гіпоксію відтворювали в модифікованій барокамері, імітуючи підйом тварин на висоту 12 000 м з атмосферним тиском 19,4 кПа та парціальним тиском кисню в повітрі 30,5 мм рт ст. Ця висота є критичною для виживання щурів. Швидкість підйому складала 50 м/с при 20-220С. На висоті щурів витримували до другого агонального вдиху, після чого здійснювали опускання на попередню нульову висоту з відновленням життєдіяльності тварин.
2.5. Евтаназія тварин та забір досліджуваного матеріалу
Евтаназію щурів виконували в світловий період доби шляхом декапітації під легким ефірним наркозом через 30 хв після припинення дії гострої гіпоксії. Пілоричний відділ шлунка, дванадцятипалу та дистальну частину худої кишок швидко вилучали та заморожували в рідкому азоті, де зберігали для подальших досліджень.
2.6. Визначення тривалості життя тварин за умов гострої гіпоксії
Cтійкість щурів до гострої гіпобаричної гіпоксії визначали за часом втрати пози на висоті 12 000 м та часом життя (від моменту досягнення висоти 12 000 м до появи другого агонального вдиху), а також за часом відновлення пози з моменту початку опускання [23, 97].
2.7. Біохімічні дослідження
Пілоричний відділ шлунку, дванадцятипалу та дистальну частину худої кишок швидко вилучали і заморожували в рідкому азоті. Для гомогенізації забирали 50 мг кожної вилученої ділянки кишечника, наважку переносили в пробірку з охолодженим 2 мл 0,05 М тріс-НСІ буфером (рН-7,4).
Екстракцію ліпідів з супернатантів проводили сумішшю гексан-ізопропанол в об'ємному співвідношенні 1:1.
2.7.1. Визначення продуктів пероксидного окиснення ліпідів. Первинні продукти пероксидного окиснення ліпідів - дієнові кон'югати і вторинні - малоновий діальдегід визначали за методами [44, 157]. Вміст зазначених продуктів визначали на спектрофотометрі СФ-46 ("ЛОМО", Росія) Кількість малонового діальдегіду та дієнових кон'югатів розраховували в нмоль/мг білка.
2.7.2. Визначення активності антиоксидантних ферментів. Активнiсть супероксиддисмутази [КФ 1.15.1.1.] визначали за кiлькiстю ферменту, необхiдного для 50% блокування вiдновленого тетразолiю в умовах дослiду [178] і виражали в од/хв*мг бiлка.
Дослідження активностi каталази [КФ 1.11.1.6] проводили за здатністю ферменту розкладати пероксид водню. Активнiсть каталази виражали в мкмоль/хв*мг бiлка [90].
Визначення активностi глутатіонпероксидази [КФ 1.11.1.9] проводили за методом [126]. Принцип методу полягає в кiлькiсному визначеннi вiдновленого глутатiону (G-SH), який не використовується в процесi ферментативної реакцiї. Активнiсть ферменту виражали в мкм G-SH/хв*мг бiлка.
Бiлок в гомогенатах визначали за методом Лоурi [271]. Принцип методу грунтується на утворенні біуретового комплексу (пептидного зв'язку білка та міді), який у присутності фенольного реактиву Фоліна-Чокальтеу дає синє забарвлення, інтенсивність якого пропорційна кількості білка.
2.7.3. Дослідження тканинного фібринолізу та необмеженого протеолізу. Тканинний фібриноліз та протеолітичну активність оцінювали за методом [101]. Для цього наважки тканин відмивали від домішок крові в охолодженому боратному буфері ( рН-7,4) і проводили гомогенізацію. По 0,5 мл 5% гомогенату тканини вносили в 2 ряди пробірок з марками "СФА" (сумарна фібринолітична активність) і "НФА" (неферментативна фібринолітична активність). У пробірки "