РОЗДІЛ 2
МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ
Для вирішення поставлених завдань всього було обстежено і проліковано 167 хворих на КО. Обстеження, лікування (стаціонарне чи амбулаторне) та наступний нагляд за хворими проводились на базі кафедри шкірних і венеричних хвороб з курсом проблем СНІДу Національного медичного університету імені О.О. Богомольця.
У всіх хворих було ретельно зібрано анамнез: початок та перебіг хвороби, чинник спадковості, супутні та раніше перенесені захворювання, наявність чи відсутність ремісій, попереднє лікування (в разі, якщо воно мало місце). Під час огляду особлива увага приділялась стану шкірного покрову: дермографізм, тургор, сало- та потовиділення, візерунок, наявність дистрофічних уражень нігтьових пластинок. Всім хворим було проведено клініко-лабораторне обстеження, яке включало загальноклінічні аналізи, триразовий аналіз калу на яйця гельмінтів, серологічні аналізи, обстеження на токсоплазмоз, ЕКГ, УЗД, консультації суміжних фахівців, дворазове імунологічне обстеження та визначення наявності в шлунку хелікобактерної інфекції.
Обстеження хворих на наявність хелікобактерної (H. pylori) інфекції в шлунку проводили двічі (до та після лікування) за допомогою дихального тесту з сечовиною, міченою 13С. Це неінвазивне дослідження є досить простим у методичному відношенні і має 100% чутливість та специфічність [63,64]. Принцип, покладений в основу уреазного 13С-дихального тесту (рис. 2.1), полягає в тому, що після перорального прийому розчину сечовини, міченої нерадіоактивним 13С, в помаранчовому соці уреаза Н. руlori метаболізує мічену сечовину та визволяє мічений вуглекислий газ, який і визначається у повітрі, що видихається, через 30 хвилин.
Процедура тесту. Згідно з протоколом проведення 13С-уреазного дихального тесту, для визначення хелікобактерного статусу шлунка хворого проводили аналіз двох проб видихнутого повітря, котрі відбиралися в спеціальні, покриті алюмінієвою фольгою, пластикові герметичні мішечки ємністю 500 мл. Першу пробу отримували до прийому субстрату (проведення дослідження натще не є обов'язковою умовою), а другу - через 30 хвилин. В якості субстрату застосовували сечовину, мічену стабільним ізотопом 13С, з розрахунку 1 мг/кг маси тіла обстежуваного, котру розчиняли в 200 мл помаранчового чи яблучного соку (для уповільнення евакуації субстрату зі шлунка). Кожна проба аналізувалась приблизно чотири хвилини, одночасно проводилося дослідження дихальних проб чотирьох пацієнтів. Результат у вигляді показника "DOB" (delta over baseline), що перевищував 3,5%, свідчив про Н. pylori-позитивний статус шлунка обстежуваного.
Рис. 2.1. Принцип 13С-уреазного дихального тесту.
В наших дослідженнях для проведення 13С-уреазного дихального тесту використовувалась німецька система IRIS фірми WAGNER з інфрачервоним аналізатором. Загальний вигляд системи зображено на рисунку 2.2.
Рис. 2.2. Загальний вигляд системи IRIS для проведення 13С-уреазного дихального тесту.
Поглиблені дослідження параметрів клітинної та гуморальної ланок імунітету проводили за допомогою тестів першого та другого рівнів згідно з рекомендаціями (1989), розробленими лабораторією клінічної імунології Наукового центру радіаційної медицини (НЦРМ) разом з Інститутом біофізики та Інститутом імунології (м. Москва) [123].
Кров у хворих на КО брали натще з ліктьової вени і вносили до пробірок, оброблених гепарином у концентрації 20 Од/мл, після чого проби доставлялися в ізотермічних контейнерах до лабораторії. Популяцію мононуклеарів виділяли у градієнті фіколоверографіну щільністю 1,076 - 1,078. Концентрація клітин у суспензії складала 1-2х109/мл. Дослідження популяційного складу лімфоцитів у реакціях розеткоутворення проводилося за способом Р.М. Хаїтова та співавт. (1983) [125]. Вивчення теофілінчутливості Е-рецептору проводилось за методикою Limatibul et al. (1987) [122]. Дослідження фагоцитозу проводилось у відповідності до рекомендацій К.Ф. Чернушенко та співавт [124]. Функціональна активність лімфоцитів периферичної крові вивчалась за допомогою реакції бласттрансформації з візуальним зчитуванням результатів [124].
Для дослідження імунного статусу ми використовували комбінації моноклональних антитіл (МКАТ), що виробляються в країнах СНД та за кордоном, поділені за кластерами диференціації (CD), що забезпечують виявлення основних субпопуляцій Т- та В-лімфоцитів. В таблиці 2.1 наведені основні характеристики МКАТ, що застосовувалися для оцінки імунного статусу.
Таблиця 2.1
Перелік комбінацій моноклональних антитіл, які використовувалися для виявлення субпопуляційної організації периферичної крові
Моноклональне антитіло 1Кластер диференціаціїМоноклональне антитіло 2Кластер диференціаціїPan-leukocyte-FITCCD45M3-PECD14Anti-mouse IgG1- FITCanti-mouse IgG1-PEAnti-Leu4- FITCCD3anti-Leu12-PECD19
Anti-Leu3a- FITCCD4anti-Leu2a-PECD8
Anti-Leu4- FITCCD3anti-HLA-Dr-PE
Anti-Leu4- FITCCD3anti-Leu11-PECD16
anti-Leu19-PE
CD56
Дослідження специфічних маркерів лімфоцитів у хворих на КО проводили методом лазерної проточної цитофлуорометрії. Дослідження були виконані на лазерному проточному цитофлуориметрі FACScan ("Becton Dickinson", США) при потужності лазера 15 мВТ, лінійному посиленні сигналів FSC (5 градусів) та SSC (90 градусів), логарифмічному - F11 та F12. Коефіцієнти електронної компенсації дорівнювали 0,8% для F11 та 18,4% для F12. Математична обробка первинних даних проводилась за допомогою програмного забезпечення LYSYS II та CЕLLfit на комп'ютері HP-340 ("Hewlett Packard", США). Дослідження проводили за допомогою прямого імунофлуоресцентного тесту з панелями моноклональних антитіл (МКАТ) Leu [261]. Контролем для дослідження були флуоресцентні мікросфери "Calibrite" ("Becton Dickinson"), мічені FITC і PE.
Для цитофлуорометричного моніторингу використовувалася панель моноклональних антитіл (МКАТ) Simultest (Becton Dickinson США). Ця панель містить контрольний набір МКАТ anti-СD45 та anti-LeuМ3, мічених FITC