РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ
2.1. Характеристика експериментальних груп тварин.
Дослідження було проведено на 563 адаптованих по масі (180-200 г) білих щурах - самцях експериментальної лінії Вістар. Відтворення експериментальної виразкової хвороби здійснювалося по методу S. Szabo [260] шляхом уведення внутрішньоочеревинно цистеаміна в дозі 350 мг/кг. Вивчення впливу нейропептидів на перебіг виразкової хвороби проводилося шляхом уведення внутрішньоочеревинно синтетичних аналогів нейропептидів. Під час проведення експериментальних досліджень щурам був забезпечений вільний доступ до їжі і води, під час утримання підтримувалися природні умови, із природною 12 - годинною зміною дня і ночі. При проведенні досліджень дотримували правил, передбачених у 1985 р. Радою міжнародних медичних організацій і викладених у ??Міжнародних рекомендаціях по проведенню медико-біологічних досліджень з використанням експериментальних тварин?? і зауважень, що були викладені в листі комісії з проблеми етики відносин до тварин [261]. Для знеболювання застосовували наркоз ефіром.
Тварини розділені на 5 груп:
1. група № 1 - інтактні тварини;
2. група № 2 - тварини з експериментальною виразковою хворобою;
3. група № 3 - тварини з експериментальною виразковою хворобою, яким була проведена терапія даларгіном у дозі 50 мкг/кг;
4. група № 4 - тварини з експериментальною виразковою хворобою, яким була проведена терапія даларгіном + ДФА в дозі 350 мкг/кг;
5. група № 5 - тварини з експериментальною виразковою хворобою, яким була проведена терапія ліподалом у дозі 50 мкг/кг.
Препарати уводили внутрішньоочеревинно. Контроль результатів здійснювали в 1,7 і 14 дні експерименту. Для контролю використовували дві групи тварин - здорові і з відтворенням виразкової хвороби, яким внутрішньоочеревинно уводили фізіологічний розчин. Евтаназію тварин проводили шляхом декапітації на 1, 7, 14 добу (по 12 щурів).
2.2. Лабораторні методи дослідження і характеристика досліджуваних речовин.
Кров тварин стабілізували 4 % розчином цитрату натрію в співвідношенні 1:10. Еритроцити відокремлювали центрифугуванням (3000 об/хв 10 хв при температурі 4(С) з наступним 3-кратним відмиванням ізотонічним розчином NaCl. Виділення еритроцитарних мембран не проводили в зв'язку з відсутністю інших мембранних органел у цих клітинах. Як суспензію плазматичних мембран використовували лізат еритроцитів, одержуваний додаванням до еритроцитів дистильованої води 1:1.
Виходячи з того, що процес перекисного окиснення ліпідів містить у собі багато шляхів метаболізму, було вирішено досліджувати кілька продуктів вільно-радикального окислювання.
2.2.1. Визначення показників антиоксидантного захисту клітини і продуктів перекисного окиснення ліпідів.
По методу В.А. Костюк [262] визначали кількість дієнових кон?югатів ненасичених вищих жирних кислот. Метод полягає в екстракції ліпідів гептан-ізопропанольною сумішшю (1:1) і потім з розшаруванням двох фаз 0,1 н. розчином HCl і спектрофотометричним визначенням продуктів ПОЛ в гептановій фазі при довжині хвилі 233 нм. Для контролю досліду використовували проби, що містили тільки екстрагувальну фазу. Для екстракції ліпідів застосовували 0,5 мл еритроцитарної маси, вміст дієнових кон?югат розраховували за формулою:
Е 233/мл еритроцитів = Д 233 х V r (для еритроцитів)
V ер
Де Д 233 - значення екстинкції, Vг - об?єм гептанового екстракту (4,5 мл); V ер - об?єм еритроцитарної суспензії (0,5 мл).
Визначення малонового діальдегіду (МДА) проводили за методом І.Д.Стальної та Т.Г. Гаришвили [263], який полягає в тому, що при температурі 100?С в кислому середовищі малоновий діальдегід взаємодіє з 2-тіобарбітуровою кислотою, при цьому утворюється розового кольору триметиновий комплекс із максимумом поглинання при 532 нм. Рівень МДА в пробі розраховували, використовуючи величину молярного коефіцієнта екстинкції - Е =1,56 х 105 см-1 М-1 за формулою С = ?Е х V х K х C, де С - кількість МДА в пробі в мкмоль/л для еритроцитів; ?Е - показник екстинкції по ФЕК; V - об?єм проби в кюветі - 3,75 мл крові; K - коефіцієнт розведення для крові.
Об'єктивним критерієм стану системи антиоксидантного захисту є активність супероксиддисмутази (СОД). Для визначення активності СОД в еритроцитах останні відмивали від плазми фізіологічним розчином при повторному центрифугуванні (t - 4(C). Гемоглобін, що заважав визначенню активності ферменту, осаджували сумішшю спирту з хлороформом. Для цього до 0,1 мл гемолізованих і розведених в 10 разів 5мМ трис-HCl (рН 7,4), еритроцитів додавали 0,25 мл етанолу і 0,15 мл хлороформу. Активність СОД визначали по методу, запропонованому С. Чеварі [264], що заснований на здатності СОД гальмувати реакцію аутоокиснення адреналіну в адренохром при рН 10,2. Інкубаційне середовище містило: 1 мл 0,15 М натрій-карбонатного буфера з додаванням 3 х 10-4 ЕДТА (рН 10,2), 0,5 мл супернатанту досліджуваного матеріалу чи води для виміру контрольної проби; 0,7 мл 0,005 М калій-фосфатного буфера з додаванням 1 х 10-5 М ЕДТА (рН 7,8); 0,4 мл 2,25 х 10-3 М водного розчину адреналіну (рН 2,5). Показання знімали спектрофотометром СФ-46 при довжині хвилі 480 нм. За умовну одиницю активності ферменту приймали кількість СОД, яке необхідно для інгібування початкової швидкості аутоокиснення адреналіну в зазначених умовах на 50%. Відсоток гальмування визначали за формулою:
Т % = Е1 -Е2 х100%
Е1
Де Е1 - початкова швидкість вільного окислювання адреналіну (контрольна проба); Е3 = Е1 - Е2 - різниця між початковою швидкістю окислювання адреналіну в контролі і досліді (опт.од./хв). Активність ферменту розраховували по формулі:
А = 2хР х Т%
(100% - Т%) х а
Де А - активність СОД в ум.од./мг білка; 2 - коефіцієнт перерахування на 1мл внесеного в кювету біологічного матеріалу; Р -розведення супернатанту; Т % - відсоток гальмування; а - кількість мг білка в нерозведеному біологічному матеріалі.