Розділ 2. МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ
2.1. Матеріали
2.1.1. Хімічні реактиви
Для приготування розчинів використовували хімічні реактиви фірм: «Sigma»
(Германія), «Pharmacia» LKB (Швеція), «Serva» (Германія), а також вітчизняні
реактиви класів: «ч», «хч», «чда», «осч».
Для виділення протопластів використовували ферменти фірм: Kinki Jakult
Biochemicals Co. (Nishinomia, Японія), Calbiochem - Behring Corp. (США). При
стерилізації ферментної суміші використовували фільтри Millipore (США).
При постановці ІФ та ІФА використовували антисироватки Інституту
сільськогосподарської мікробіології УААН (Україна) та НДІ епідеміології та
мікробіології ім. М.Ф.Гамалії (Росія).
2.1.2. Регіон відбору вірусного матеріалу
Відбір природних ізолятів ВТМ здійснювали на території Канівського природного
заповіднику, який знаходиться на Правобережному Середньодніпровўї і займає
територію 2027 га. Більш як 70% території заповідника лежить у межах
дислокованої четвертої надзаплавної тераси Дніпра. Ця територія значно піднята
над рівнем моря і сильно розчленована ерозією, має вигляд гір.
Материнською основою ґрунту є лесовидні суглинки. Найтиповіший варіант
ґрунтового покриву в цьому районі - різні відміни сірих лісових ґрунтів на
лесовидних суглинках та дернові лісові ґрунти на нелесових породах. Головні
показники клімату: середньорічна температура повітря +8°С; середня температура
липня +20°С; січня -5°С; середньорічна кількість опадів – 520 мм. Сукупність
природних лісорослинних умов визначає панівне положення тут
широколистяно-лісових ценозів.
В межах території Канівського природного заповіднику зростає 973 види судинних
рослин, що відносяться до 110 родин і 471 роду. Найбільш широко представлені
видами родини: Asteraceae, Poaceae, Fabaceae, Lamiaceae, Cyperaceae,
Caryophyllaceae, Rosaceae та Scrophulariaceae [51].
2.1.3. Відбір досліджуваного матеріалу та підбір ізолятів
Досліджуваний матеріал відбирали за зовнішніми симптомами (мозаїка,
хлоротичність, скручування, некрози та ін.) з рослин родин Caprifoliaceae,
Plantаgiaceae, що зростали на території Канівського природного заповідника. Як
рослини-індикатори використовували Datura stramonium, Nicotiana glutinosa,
Nicotiana rustica, Chenopodium amaranticolor [7]. Чисту лінію вірусів
отримували через некрозоутворюючі рослини Datura stramonium, Nicotiana
glutinosa. Як рослини-накопичувачі використовували рослини Nicotiana tabacum
cv.Samsun, що інфікуються системно.
Ізоляти для кожного варіанту дослідів відбирались за схемою: первинний скринінг
за симптомами, стійкість за інфекційністю, рівнем вивченості та ін. Всі ізоляти
на перших етапах дослідів тестувались на відповідних варіантах модельних
систем, що давало змогу підібрати ізоляти ВТМ для відповідних досліджень.
2.2. Методи дослідження
2.2.1. Отримання ізолятів вірусу
Відбір досліджуваних рослин проводили за візуальною діагностикою габітусу на
наявність симптомів вірусної інфекції. Відбір проводили за трьома типами
патологічних змін: некротизація, системне ураження, слабко виражена мозаїка.
Відібраний матеріал піддавали серологічному, електронномікроскопічному та
біофізичному аналізам. В якості біологічного методу контролю на наявність ВТМ
слугували рослини-індикатори: Datura stramonium, Nicotiana glutinosa, Nicotiana
rustica, Chenopodium amaranticolor, Nicotiana tabacum cv.Samsun.
Чисту лінію вірусу, яку використовували при подальших дослідженнях, отримували
в результаті 5-6 пасажів через некрозоутворюючі рослини (Datura stramonium,
Nicotiana glutinosa) і рослини-накопичувачі (Nicotiana tabacum), що інфікуються
системно, шляхом механічної інокуляції соку з інфікованих рослин. При пасажах
брали сік з листя від рослин, що мали середній ступінь ураження. Листя молодих
рослин посипали з верхньої сторони дрібнодисперсним абразивом, наносили певну
кількість розведеного інфекційного соку і обережно втирали скляним шпателем в
поверхню листка. При цьому листок із зворотного боку підтримували предметним
склом, обгорнутим фільтрувальним папером. Інокульовані листки ретельно
промивали водою до видалення абразиву. Після декількох пасажів через одиничні
некрози вірус виділяли із системно уражених рослин Nicotiana tabacum.
2.2.2. Очищення вірусу
Наважку листя рослин 0,1-0,5 кг гомогенізували в 0,1 М фосфатному буфері рН 7,4
на холоді. Співвідношення листя і буферу складало 1:2 (вага/об’єм).
Екстракт освітлювали хлороформом при співвідношенні гомогенат/хлороформ 1:5 за
об’ємом. Для зв’язування двохвалентних іонів Mg і Са використовували ЕДТА в
кінцевій концентрації 0,01М. Низькошвидкісне освітлення екстракту при 4-5
тис. об/хв протягом 20 хв. для отримання вірусовмісного супернатанту
здійснювали на центрифузі РС-6. Подальше очищення проводили методом
диференційного центрифугування на ультрацентрифузі «Beckman» (Германія) у
підвісних стаканах бакет-ротора SW-40 при 30000 об/хв, t 4°С, протягом 1,5 год.
Осад суспендували в невеликому об’ємі 0,1 М фосфатного буфера і центрифугували
при 4-5 тис об/хв протягом 20 хв. на центрифузі РС-6, для видалення осаду, що
не розчинився.
Для достатнього ступеню очистки вірусного препарату проводили 2-3 цикли
диференційного центрифугування Очищений препарат вірусу зберігали в аліквотах
при -10-12°С.
Концентрацію вірусу визначали спектрофотометрично, на спектрофотометрі СФ-46,
за формулою: C = A260N/Ke
де С – концентрація вірусу в мг/мл, А260 – екстинкція при довжині хвилі 260 нм,
N – розведення вірусного препарату, Ке – коефіцієнт екстинкціі для ВТМ
становить 2,7 [2].
2.2.3. Метод електронної мікроскопії
Морфологію вірусних часток вивчали методом електрон
- Київ+380960830922