ГЛАВА 2
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Исследования выполнены на 920 половозрелых крысах линии Вистар обоего пола массой 150-240 г. В эксперименте использовались животные после прохождения карантина в условиях вивария ЛГМУ в течение 14 дней.
Опыты проводились с учетом "Правил доклинической оценки безопасности фармакологических средств (GLP) [349]. Животные получали стандартную диету в виде сбалансированного гранулированного корма по установленным нормам. Доступ крыс к воде был свободным. Забой животных осуществляли путем декапитации в полном соответствии с "Методическими рекомендациями по выведению животных из эксперимента" [350].
Экспериментальной моделью служил патологический процесс, развивающийся у подопытных животных, подвергшихся необратимой одномоментной двусторонней окклюзии общих сонных артерий до места ее бифуркации на наружную и внутреннюю ветви. Оперативное вмешательство проводили под натрий-тиопенталовым (70 мг/кг) наркозом путем рассечения на шее вдоль трахеи кожи, тупого расслоения подкожно-жировой клетчатки и мышц с последующим отпрепарированием правой и левой общих сонных артерий и перевязкой их шелковой лигатурой. Ушивание операционного доступа осуществлялось послойно с обработкой кожи 2% раствором бриллиантового зеленого.
Первичный фармакологический скрининг потенциальных церебропротекторных средств проводили на выше описанной экспериментальной модели среди 11 препаратов с различными механизмами действия. Изучаемые лекарственные средства вводили однократно в изоэффективных дозах (заимствованных из литературы) [351-355] с профилактической целью внутрижелудочно (взвесь напроксена, фламина и силибора) либо внутрибрюшинно (пикамилон, пирацетам, ацетилцистеин, ацелизин, эмоксипин, тиотриазолин, димексид, флавинат), соответственно, за 90 и за 30 минут до начала моделирования изучаемой цереброваскулярной патологии. Противоишемическую эффективность препаратов оценивали в динамике по показателям летальности и средней продолжительности жизни животных, а также по клиническим особенностям течения острой цереброваскулярной недостаточности у крыс с двусторонней окклюзией общих сонных артерий.
При разработке дозового режима применения комбинации наиболее эффективных, по результатам проведенного скринингового исследования, церебропротекторных средств - ацелизин ("Київмедпрепарат") и тиотриазолин (Запорожское НПО "Фарматрон") - вводили однократно внутрибрюшинно в различных дозах (10; 95; 200 мг/кг) и в разные временные интервалы относительно момента двусторонней перевязки общих сонных артерий. Эффективность препаратов оценивали по выживаемости крыс (через 24 часа после лигирования каротидных сосудов). Математическую зависимость эффекта от доз исследуемых препаратов определяли методом двухфакторного эксперимента [354] по специально разработанной нами программе для Pentium 200 MMX в среде Turbo Pascal V.7.0.* Анализ функции и расчет оптимальных доз проводили графически с помощью программы Mach Engine V 2.001, содержащей функции анализа, графики и линейной алгебры.
Оптимальное время введения комбинации изучаемых церебропротекторных средств определяли путем экстраполяции эффектов в рассчитанных ранее наиболее эффективных дозах в дискретные моменты времени (240,120, 60 минут до перевязки обеих общих сонных артерий, в момент их окклюзии, а также через 60 и 120 минут после перевязки) на квадратичную функцию с дальнейшим ее анализом.
______________
* Выражаем искреннюю благодарность к.м.н., ассистенту Д.С.Кравцу за оказанную помощь по разработке компьютерной программы
Экстраполяцию доз ацелизина в комбинации с тиотриазолином, полученных в эксперименте, на человека проводили с помощью метода, предложенного
Рыболовлевым Ю.Р. и Рыболовлевым Р.С. (1979 г.), по константам биологической активности [356]:
D1= R1 x D2 / R2 ,
где D1 - искомая доза для человека,
R1 - коэффициент видовой выносливости для искомого вида млекопитающих (человека),
D2 - исходная доза для известного вида млекопитающих (в нашем случае - для крыс),
R2 - коэффициент видовой выносливости для известного вида млекопитающих.
Биосубстратом для проведения биофизических и биохимических исследований, необходимых для решения поставленных в диссертационной работе задач, служили сыворотка крови и гомогенаты трех структур ГМ - коры, гиппокампа и ствола, приготовленные на охлажденном (4°С) изотоническом растворе хлорида натрия.
Скорость протекания свободно-радикальных реакций в мембранных структурах клеток нервной ткани оценивали биохемилюминисцентным (БХЛ) методом при помощи люминометра EMILITE -1105 австро-немецко-российского производства фирмы "Био-Хим-Мак". Спектральный диапазон хемилюминометра составлял 350-950 нм, а диапазон измерений - 103 -1010 фотон/с. В основу метода положено измерение сверхслабого свечения, возникающего в результате неферментативного аутоокисления ненасыщенных жирных кислот фосфолипидов и реализующегося генерацией свободных радикалов, взаимодействующих с кислородом и образующих пероксиды, которые рекомбинируя, излучают кванты света. Для индукции свободнорадикальных реакций был использован 3% раствор перекиси водорода по методу, описанному Е.П.Сидориком с соавт. [357], c применением предложенных сотрудниками кафедры фармакологии ЛГМУ усовершенствований [358]. При анализе полученных биохемилюминограмм оценивали следующие показатели: амплитуду быстрой вспышки (I1), амплитуду медленной вспышки (I2) и константы скоростей изменения интенсивности свечения (К1 и К2), определяемые по тангенсу угла наклона кинетической кривой.
Для исследования влияния изучаемой комбинации церебропротекторных средств на течение свободно-радикальных процессов была проведена серия модельных опытов in vitro с помощью метода БХЛ. В качестве субстрата использовался стерильный 10% раствор альбумина (Луганская ОСПК), который обеспечивает наибольший вклад в сумм
- Київ+380960830922