РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
Для вирішення поставлених завдань було досліджено 101 біоптат легень з наявністю туберкульозного і неспецифічного запалення та з мікотичним ураженням легень.
Враховуючи різний характер ураження легень, біоптати були поділені на чотири групи, які віддзеркалювали основний напрямок проведення досліджень. Так, до групи 1 були віднесено 47 біоптатів легень хворих, що були уражені туберкульозом у поєднанні з мікозом, контролем до якої були 11 біоптатів легень хворих, що були уражені лише на туберкульоз (група 1 к). 2 група складалася з 30 біоптатів легень хворих з мікотичним ураженням і наявністю неспецифічного (нетуберкульозного) запального процесу, контролем до якої були 13 біоптатів легень хворих лише з запальними неспецифічними ураженнями легень, що склали групу 2 к.
Матеріалом для гістологічного та гістохімічного аналізу стали шматочки легень, які були вилучені при оперативному лікуванні у хірургічній клініці інституту у плановому порядку. Нозологічні ознаки патологічних станів визначені за загальновідомими класифікаціями [7].
Тканини легень, вилучених у стерильних умовах, частково спрямовувалися на мікробіологічне дослідження, де вони подрібнювалися за допомогою скальпелю або ножиць. Після цього їх засівали на різні поживні середовища: загальноприйняте середовище Сабуро тверде, середовище Сабуро рідке, середовище Сабуро з додаванням 20 % сироватки крові, середовище Сабуро з додаванням дріжджового екстракту, напіврідке середовище Сабуро з заливанням після посіву стерильним вазеліновим маслом для створення анаеробних умов.
Використовували по 2 пробірки кожного поживного середовища, засіви інкубували при температурі 37 ?С протягом тижня, пiсля чого спостерiгали за засiвами при температурі 28 ?С протягом двох місяців. В деяких випадках, при визначенні невиразного росту мікроміцетів, проводився перезасів і культивування на чистому поживному середовищі. Таким чином було проведено 1078 мікробіологічних досліджень.
У культурі грибів, що виросли, проводили макроскопію колоній, дослідження мікроскопічних препаратів з метою визначення виду гриба. Дослідження проводили декілька разів з інтервалом в 3 - 4 дні, спостерігаючи за зміною росту грибів. Ідентифікацію роду та виду грибів, що виросли, проводили на основі співставлення культуральних макро- і мікроскопічних ознак, а також особливостей тканинних форм за визначником патогенних, токсичних і шкідливих для людини грибів [34].
У 38 випадках у біопсійному матеріалі з наявністю туберкульозного і неспецифічного запалення при мікробіологічному дослідженні були висіяні такі види мікроміцетів: плісняві - 27 випадків (Aspergillus - 10 випадків, Penicillum - 7 випадків, Mucor - 10 випадків), дріжджоподібні - 8 випадків (Cryptococcus - 5 випадків, Candida - 2 випадки, Geotrichum - 1 випадок) променисті - 3 випадки (Nocardia - 2 випадки, Actinomyces 1 випадок) (табл. 2.1).
Відібраний для гістологічного дослідження матеріал розрізали на шматочки розміром 0,5 - 1,0 см та фіксували у 10 % розчині формаліну протягом 24 - 48 годин. Критерієм закінчення фіксації було рівномірне ущільнення шматочків і однаковий його вигляд як з поверхні, так і на контрольному зрізі. Після фіксації шматочки промивали протягом 30 хвилин у проточній воді [43].
Таблиця 2.1.
Кількість мікроміцетів виділених з тканин легень
при мікробіологічних засівах
Групи мікроміцетівВид мікроміцетівKiлькiсть спостережень (n=38)абс.% від загалуПліснявiAspergillus1026,3Penicillium718,4Mucor1026,3ПроменистіNocardia25,3Actinomyces12,6ДріжджоподібніCryptococcus513,2 Geotrichum12,6 Candida25,3
Наступним етапом підготовки гістологічного матеріалу було зневоднення, шляхом проведення його по спиртовим розчинам зростаючої концентрації: 70?, 96?, 100? - по 24 години у кожному розчині. Далі шматочки уміщували у суміш спирту з ксилолом на 1 - 3 години, у ксилол (по 3 години у двох порціях). У суміші ксилолу з парафіном матеріал витримували 2 - 3 години при температурі 37 ?С. Потім вони витримувалися у двох змінах чистого парафіну протягом 2 - 4 годин при температурі 58 ?С та заливалися у чистий парафін з формування гістологічних блоків.
З парафінових блоків за допомогою санного мікротому виготовляли зрізи товщиною 6 - 8 мкм та надтонкі зрізи 2 - 4 мкм і розташовували їх на предметних скельцях. Надтонкі зрізи виготовляли за оригінальною методикою. При виготовленні зрізу з гістологічного блока на санному мікротомі, спочатку мікротомним ножем знімають надлишок заливального матеріалу, потім шар за шаром зрізають блок до необхідної глибини і після цього починають робити зрізи на предметне скло. Товщина отриманого зрізу залежить як від технічних характеристик мікротому, якості заливального матеріалу, так і від виду тканини, що зрізається. Так, тканини легень мають підвищену пористість і при виготовленні тонкого зрізу (наприклад, для гістохімічних досліджень) часто сильно деформуються і навіть руйнуються, що не дозволяє аналізувати тонкі структури і проводити морфометричні виміри.
З метою уникнути технологічних ускладнень при виготовленні тонких гістологічних зрізів нами запропоновано оригінальний метод, за яким блок із поміщеними у заливальний матеріал тканинами фіксують у мікротомі, знімають надлишок заливального матеріалу, зачищають блок до необхідної глибини, потім на його поверхню гістологічним шпателем наносять шар матеріалу, що заливають, підводять блок до ножа на рівень, що значно менший за технологічно допустиму величину і роблять зріз. Такий зріз складається з дуже тонкого шару тканин зразка і додаткового шару матеріалу, що заливають (наприклад, парафіну). Така різка дозволяє уникнути деформації тканин і додаткових вібрацій ножа, що супроводжують процес виготовлення тонких зрізів. Після цього на предметному склі проводять депарафінізацію препарату, при цьому верхній шар парафіну розчиняється і оголює зріз самої тканини.
Порівняння пар