РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ
2.1. Матеріали дослідження
Нами вивчалися цитологічні мазки з піхвової поверхні та цервікального каналу шийки матки 110 жінок фертильного віку в фолікуліновій фазі менструального циклу (5-12 день менструального циклу).
Досліджений матеріал було розподілено на наступні групи (таблиця 2.1):
- контрольну групу спостережень становили цитологічні мазки від жінок без проявів запальних процесів репродуктивних органів (1 група, вірус-негативна) - 20 досліджень;
- до 2 групи увійшли цитологічні мазки від жінок з ВПЛ-інфікуванням (тип 16, 18) - 30 досліджень;
- до 3 групи увійшли цитологічні мазки від жінок з інфікуванням ВПЛ (тип 16, 18), асоційованим з ВПГ 2-го типу - 30 досліджень;
- до 4 групи увійшли цитологічні мазки від жінок зі змішаним бактеріальним інфікуванням (гарднерела, факультативно анаеробні коки), асоційованим з трихомонадною інфекцією - 30 досліджень.
Таблиця 2.1
Кількість дослідженого матеріалу по групам та методи дослідження
Групи дослідженняМетоди дослідженняЗагальноцитологічніІмуноцито-хімічніМорфо-
метричніГрупа 1202020Група 2302020Група 3302020Група 4302020Всього1108080
Матеріал набрано від жінок, які знаходились на обстеженні у відділенні проблем здоров'я жінок фертильного віку Інституту педіатрії, акушерства та гінекології АМН України, при первинному зверненні пацієнток, тобто до проведення будь-якої терапії.
2.2. Методи дослідження
Цитологічні мазки були взяті із піхвової поверхні шийки матки шпателем Ейра та із цервікального каналу спеціальною щіточкою "Cervex-Brush" для отримання матеріалу із зони трансформації. Після забору матеріал наносили тонким шаром на скельце, висушували на повітрі, фіксували у суміші Нікіфорова 10-20 хв. і потім фарбували. Для імуноцитохімічного дослідження мазки після висушування на повітрі поміщали в морозильну камеру (-20єС).
Для вирішення поставлених завдань у дослідженні були використані наступні методи:
1) загальноцитологічні - забарвлення за Романовським - Гімзе та Папаніколау;
2) морфометричні:
а) підрахунок клітин з дистрофічними змінами (жирова та гідропічна дистрофії) у перерахунку на 500 клітин;
б) підрахунок клітин, які характеризують запальну інфільтрацію (нейтрофілів, лімфоцитів та макрофагів) у перерахунку на 500 клітин;
в) підрахунок клітин, які характеризують диспластичні зміни в епітелії під впливом бактеріальних та вірусних агентів (дискаріоз, паракератоз, койлоцитоз, дво- та багатоядерність, дезагрегація хроматину та ін.) в перерахунку на 500 клітин;
г) індекс апоптоза (ІА) визначали за результатами імуноцитохімічного дослідження (кількість позитивно забарвлених клітин поділену на 1000 клітин і помножену на 100 %);
д) індекс проліферації (ІП) визначали за результатами імуноцитохімічного дослідження (кількість позитивно забарвлених клітин поділену на 1000 клітин і помножену на 100 %);
3) імуноцитохімічні:
а) непрямий стрептавідин-пероксидазний метод виявлення експресії антигену Fas(Apo-1/CD95);
Принцип методу полягає у виявленні експресії антигену рецепторів Fas(Apo-1/CD95) за допомогою первинних і вторинних Kit моноклональних антитіл до антигену Fas(Apo-1/CD95).
Протокол реакції: фіксація мазків після заморожування (-20є С) в ЗФА (забуферений формалін-ацетон), блокування ендогенної пероксидази 3-процентним розчином пероксиду водню, промивка в фосфатному буфері рН 7,4 (PBS), блокування неспецифічних протеїнових сполук двома краплями 1- процентного бичачого сироваткового антигену (BSA), промивання в фосфатному буфері рН 7,4 (PBS), нанесення первинних антитіл до антигену Fas(Apo-1/CD95) (фірма DAKO, Данія) на одну годину. Промивання в PBS - буфері і нанесення вторинних антитіл на 30 хв.. Промивання в PBS-буфері, нанесення двох крапель комплексу стрептавідин-пероксидази та інкубація на протязі 30 хв., промивання і нанесення АЕС - хромоген-розчину, інкубація від 5 до 20 хв., до появи червоно-коричневого забарвлення, з наступним дофарбовуванням гематоксиліном Майєра.
б) непрямий стрептавідин-пероксидазний метод виявлення експресії антигену, який кодує синтез протеїну всl-2;
Дана методика визначає ступінь експресії антигену, який кодує синтез антиапоптотичного протеїну всl-2 за допомогою первинних і вторинних Kit моноклональних антитіл до антигену всl-2.
Протокол реакції: фіксація мазків після заморожування (-20є С) в ЗФА, блокування ендогенної пероксидази 3-процентним розчином пероксиду водню, промивання в фосфатному буфері рН 7,4 (PBS), блокування неспецифічних протеїнових сполук двома краплями 1-процентного бичачого сироваткового антигену (BSA), промивання в фосфатному буфері рН 7,4 (PBS), нанесення первинних антитіл до антигену всl-2 (фірма DAKO, Данія) на одну годину. Потім промивання в PBS-буфері і нанесення вторинних антитіл на 30 хв. Промивання в PBS-буфері, нанесення двох крапель комплексу стрептавідин-пероксидази та інкубація на протязі 30 хв., промивання і нанесення АЕС - хромоген-розчину, інкубація від 5 до 20 хв., до появи коричнево-червоного забарвлення, з наступним дофарбовуванням гематоксиліном Майєра.
в) непрямий стрептавідин-пероксидазний метод виявлення експресії рецепторів до прогестерону;
Протокол реакції: фіксація мазків після заморожування (-20є С) в ЗФА, блокування ендогенної пероксидази 3-процентним розчином пероксиду водню, блокування неспецифічних протеїнових сполук двома краплями 1-процентного бичачого сироваткового антигену (BSA), промивання в фосфатному буфері рН 7,4 (PBS), нанесення первинних антитіл до рецепторів прогестерону (фірма DAKO, Данія) на одну годину. Потім промивання в PBS-буфері і нанесення вторинних антитіл на 30 хв. Промивання в PBS-буфері, нанесення двох крапель комплексу стрептавідин-пероксидази та інкубація на протязі 30 хв., промивання і нанесення АЕС-хромоген-розчину, інкубація від 5 до 20 хв., до появи коричнево-червоного забарвлення, з наступним дофарбовуванням гематоксиліном Майєра.
г) н
- Київ+380960830922