РОЗДІЛ II
МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
2.1. Виклад загальної методики і основних методів досліджень.
Досягнення поставленої мети здійснювали дослідженнями по застосуванню ПЛР в порівняльному аспекті з існуючими у практиці ветеринарної медицини серологічними і бактеріологічними методами діагностики хламідіозу свиней на моделі патологічного матеріалу, відібраного у експериментально інфікованих і спонтанно захворілих тварин.
При виконанні даної роботи нами застосовувались такі методи лабораторних досліджень як реакція зв'язування комплементу (РЗК), культивування хламідій на курячих ембріонах та лабораторних білих мишах, мікроскопічні дослідження гістологічних препаратів, мазків та мазків-відбитків і безпосередньо метод ПЛР-діагностики.
Гістологічні препарати готували та фарбували науковці кафедри гістології Української медичної стоматологічної академії.
Вивчали та фотографували гістологічні препарати та мазки-відбитки за допомогою біологічного дослідницького універсального мікроскопу
"МБІ-15".
Загальний аналіз крові (РОЕ, виявлення концентрації гемоглобіну, підрахунок формених елементів крові, лейкоцитарна формула) проводився фахівцями лабораторії біохімії та імунології Полтавського філіалу ІВМ УААН за загальноприйнятими методиками.
Для підрахунку формених елементів крові та лейкоцитарної формули використовувались біологічний мікроскоп "Біолам Р-17", камери Горяєва та одинадцятиклавішний лічильник для підрахунку лейкоцитів.
Для виділення ДНК із біопроб та постановки ПЛР використовували центрифугу ОПн-8. Постановку ПЛР (ампліфікацію) здійснювали на автоматичному ампліфікаторі генів ААГ-56. Продукти ампліфікації аналізували в електрофоретичній камері "mini VAGOPHOR 01" з візуальною оцінкою на трансілюмінаторі виробництва НВО "Прогрес" та фотографували фотоапаратом "Зеніт-TTL" на плівку "Мікрат-300".
В роботі використано 6 поросят-гнотобіотів, 152 лабораторні білі миші та 129 курячих ембріонів.
2.2. ПЛР-метод діагностики хламідіозу.
Для виділення ДНК та проведення ПЛР нами використовувались набори реагентів "Полімік" фірми "Літех", розроблені НДІ фізико-хімічної медицини міністерства охорони здоров'я Російської федерації для діагностики хламідійних інфекцій людини, ТУ-9398-405-17253567-96.
Набір для виділення ДНК із біопроб (на 100 зразків) містить:
1. Розчин I (лізуючий) 30 см3
2. Розчин II (промивний) 10 см3
3. Розчин III(промивний) 200 см3
4. Сорбент 1000 мкл
5. ТАЕ буфер 5 см3
Набір для проведення ПЛР (на 100 зразків) містить:
1. Реакційну суміш 300 мкл
2. Taq-полімеразу (5 од/мкл) 25 мкл
3. Воду деіонізовану 2 см3
4. Вазелінову олію 2 мкл
5. ДНК контрольну Chl.(10-12 г ДНК на 10 реакцій) 50 мкл
До складу реакційної суміші входять: розчин dNTP, розчин специфічних праймерів, ПЛР-буфер, барвник (крезоловий червоний), внутрішній контроль (рекомбінантна плазміда, що містить вставку розміром 308 п.н.).
Внутрішній контроль дозволяє контролювати процес проходження реакції ампліфікації, а також тестувати наявність в пробах речовин, які інгібують полімеразну ланцюгову реакцію. Смуга, яка відповідає внутрішньому контролю, повинна проявлятися в агарозному гелі як у позитивному і негативному контролях, так і в усіх пробах, що тестуються.
Полімеразна ланцюгова реакція складається з трьох основних етапів - виділення ДНК із біопроби, безпосередньо ПЛР (ампліфікації) та реєстрації результатів за допомогою електрофорезу.
2.2.1. Виділення ДНК із клінічного зразка. До 100 мкл фізіологічного розчину, що містить клінічний або патологічний матеріал, в пробірці типу "Eppendorf" місткістю 1,5 см3 додавали 300 мкл розчину I та 10 мкл суспензії сорбенту. Проби інкубували протягом 10 хвилин при кімнатній температурі, 1-2 рази перемішуючи на вортексі, або струшували вручну, і центрифугували протягом 15 секунд на центрифузі ОПн-8 при 8-12 тис. об/хв. Після чого супернатант відкидали, а до осаду додавали 100 мкл розчину II і перемішували за допомогою вортекса, або струшували вручну. Сорбент осаджували центрифугуванням протягом 15 секунд при 8-12 тис. об/хв і відкидали супернатант. Процедуру відмивання повторювали двічі з використанням розчину III. Пробірки з осадом поміщали в термостат і підсушували протягом 5 хвилин при 45-55?С. Потім в пробірки із сорбентом вносили по 50 мкл ТАЕ буферу, закривали їх, струшували і інкубували протягом 5 хв в термостаті при 45-55?С. Після чого пробірки центрифугували протягом 15 сек. при 8-12 тис. об/хв. Одержаний супернатант використовували як дослідний зразок для постановки реакції ампліфікації.
На всіх стадіях обробки клінічного (патологічного) матеріалу видалення супернатанту проводили за допомогою одноканальних мікродозаторів змінних об'ємів "Finnpipette Digitals" з одноразовими пластиковими наконечниками "Finntip".
2.2.2. Постановка ПЛР (ампліфікації). В пронумеровані і розміщені у штативі відповідним чином пробірки типу "Eppendorf" місткістю 0,5 см3 переносили по 5 мкл зразку з обробленої клінічної або патологічної проби, а у пробірки, помічені як позитивні контролі, по 5 мкл ДНК позитивних контролей та по 5 мкл деіонізованої води у пробірки, помічені як негативні контролі.
Набір для проведення ампліфікації виймали з морозильної камери і поступово розморожували вміст пробірок на льодовій бані. Після розморожування готували суміш реактивів для проведення реакції у відповідності до кількості проб, що аналізуються, з розрахунку на одну пробу 17,5 мкл води, 2,5 мкл реакційної суміші та 0,2 мкл Taq-полімерази, причому, всі компоненти додавали окремими наконечниками. Після додавання Taq-полімерази суміш ретельно перемішували за допомогою піпетування.
Далі в кожну пробірку, яка містила 5 мкл зразку та позитивний і негативний контролі, додавали по 20 мкл ампліфікаційної суміші. Після чого в кожну пробірку вносили по краплині (близько 25 мкл) мінерального масла для запобігання випаровування.
Потім пробірки закривали і центрифугу