РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО І КЛІНІЧНОГО ДОСЛІДЖЕННЯ ТА КЛІНІЧНА ХАРАКТЕРИСТИКА ХВОРИХ НА ГОСТРИЙ ПАНКРЕАТИТ
2.1. Методика моделювання гострого експериментального панкреатиту
При виборі моделі гострого панкреатиту ми керувалися протоковою теорією ГП, згідно якої захворювання розвивається в результаті закидання жовчі в протоки підшлункової залози. Протокову теорію підтверджують клінічні спостереження ряду авторів, що вказують на високий відсоток біліарної етіології ГП, який коливається від 30 до 62 % [3]. В експериментах на тваринах доведено, що введення жовчі в панкреатичну протоку призводить до негайного інтенсивного набряку залози, який надалі переходить у важкий геморагічний панкреатит [240]. Для експерименту в якості піддослідних тварин були обрані коти, в яких протока підшлункової залози відкривається в загальну жовчну протоку вище впадіння останньої в ДПК, а будова і анатомічне розміщення ПЗ близькі до анатомічної будови ПЗ в людини. Для усунення можливих впливів статевих гормонів на функцію ендокринних клітин ДЕС у самок, для експерименту підбиралися статево зрілі коти-самці впродовж осінньо-зимового сезонів. Для моделювання гострого панкреатиту використовували методику Ю.М. Лопухіна [240]. Експериментальний панкреатит моделювали на 48 безпородних котах-самцях масою 1,8-3,5 кг. Всі тварини були поділені на 4 групи. Першу (контрольну) групу складали інтактні тварини (6 котів). До II-ї групи входили тварини з експериментальним панкреатитом, які не отримували лікування нейропептидами (18 котів). Третю групу складали тварини з експериментальним панкреатитом, які отримували лікування Сандостатином(r) (12 котів) і IV-ту групу - тварини, яких лікували Даларгіном(r) (12 котів).
Знеболювання здійснювали внутрішньом'язовим введенням каліпсолу з розрахунку 5-7 мг/кг маси тварини. Через 7-10 хв після його введення кота фіксували на спині на операційному столі. Після обробки операційного поля 3 % спиртовим розчином йоду виконували лапаротомію. Виділяли підкову ДПК і гепатодуоденальну зв'язку. Загальну жовчну протоку перев'язували лігатурою відразу над ДПК, але дистальніше від місця впадіння в неї протоки підшлункової залози. Після цього проводили стимуляцію зовнішньосекреторної функції підшлункової залози пілокарпіном в розрахунку 10 мг/кг маси тіла тварини. Евтаназію тварин проводили методом передозування ефірного наркозу, після чого забирали шматочки ПЗ та низхідного відділу дванадцятипалої кишки для гістологічного дослідження і електронної мікроскопії. Як показали прижиттєві спостереження за станом підшлункової залози і дані секцій тварин, зміни, що відповідають інтерстиціальній формі гострого панкреатиту спостерігали вже упродовж перших 1,5-2 годин експерименту. Геморагічний панкреатит розвивався упродовж 4-6 годин, некроз підшлункової залози спостерігали через 6-8 годин від початку експерименту. Враховуючи це, евтаназію тварин II-ї групи (18 котів) проводили відповідно до вказаних термінів. Евтаназію тварин III-ї і IV-ї груп виконували на 2-3 доби від початку експерименту і порівнювали отримані дані з контролем та результатами дослідження у тварин II-ї групи.
Тварини III-ї групи (12 котів) отримували Сандостатин(r) за 1 год до початку експерименту внутрішньом'язово в дозі 0,0015 мг/кг маси тіла та після моделювання панкреатиту внутрішньом'язово в дозі 0,0015 мг/кг маси тіла двічі на добу протягом 2-3 діб. Тварини IV-ї групи (12 котів) отримували Даларгін(r) за аналогічною схемою в дозі 5 мкг/кг маси двічі на добу.
Для гістологічного дослідження шматочки ПЗ і дванадцятипалої кишки фіксували в 12 % розчині нейтрального формаліну, заливали в парафін, а після виконання гістологічних зрізів фарбували їх гематоксилін-еозином. Враховуючи те, що при гострому панкреатиті ендокринні клітини в тканині підшлункової залози відомими методами фарбування виявити неможливо, досліджували ендокринні клітини слизової оболонки ДПК, яка, згідно даних В.В. Яглова, є "ендокринним центром шлунково-кишкового тракту" [241]. Для виявлення ендокринних клітин в слизовій ДПК гістологічні препарати фарбували методами Грімеліуса (аргірофільні клітини) та Масона-Гамперля (аргентафінні клітини) [242]. Підрахунок кількості виявлених клітин проводили в 100 криптах та 100 ворсинках, зрізаних поздовжньо. При підрахунку ендокринних клітин вивчали ступінь заповненості їх секреторними гранулами за В.І. Талапіним [243]. Виділяли чотири групи клітин: 1 - клітини з поодинокими розсіяними секреторними гранулами; 2 - клітини, в яких секреторні гранули займають 1/3 об'єму; 3 - клітини, в яких секреторні гранули займають 2/3 об'єму; 4 - клітини, повністю заповнені секреторними гранулами. Використовуючи вказаний поділ ендокринних клітин для характеристики сумарної завантаженості їх секреторними гранулами, визначали грануляційний індекс (ГІ):
ГІ = n1 x 1 + n2 x 2 + n3 x 3 + n4 x 4, (2.1)
де n - кількість клітин у кожній групі, а цифра - номер групи. Для вираження середньої завантаженості гранулами однієї клітини застосовували індекс насичення (ІН):
ІН = ГІ / n0, (2.2)
де n0 - кількість клітин у всіх групах.
Використовуючи вказані індекси, вивчали зміни функціонального стану ендокринних клітин слизової оболонки ДПК котів під впливом синтетичних нейропептидів в умовах експериментального панкреатиту та порівнювали їх з відповідними даними у інтактних тварин.
Для електронної мікроскопії шматочки тканини ПЗ фіксували упродовж 2-2,5 год в охолодженому 2 % розчині чотириокису осмію, приготовленому на 0,05 моль/л фосфатному буфері (рН 7,3), зневоджували у спиртах зростаючої концентрації, заливали сумішшю епон-аралдітних смол. Далі готували на ультрамікротомі "TESLA" BS-490 ультратонкі зрізи, які контрастували цитратом свинцю та ураніл-ацетатом і досліджували під електронним мікроскопом ПЕМ-125К. Вивчали ультраструктурні зміни кровоносних і лімфатичних капілярів підшлункової зал