РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
2.1. Матеріали дослідження
Експериментальну частину роботи було проведено на білих лабораторних щурах
різного віку та статі (самців - 112, самиць - 136, новонароджених - 243).
Тварини знаходилися в стандартних умовах із циклічністю доби: світло - 12
годин, ніч - 12 годин.
Для досліджень використовувався мозок щурів. Декапітація тварин проводилася під
швидким ефірним наркозом.
Біохімічні та гістохімічні методи дослідження були проведені з використанням
хімічно чистих реагентів фірм Sigma (США), Serva (США), Fluka (Швейцарія),
ANAWA (Німеччина), Medix Biochemica (Фінляндія), Реагент (Дніпропетровськ,
Україна).
2.2. Отримання білкових фракцій з мозку
Гомогенізація тканини мозку проводилася в буфері А, що містив трис-НCl - 0,25
мМ, рН 7,4, ЕДТА - 1 мМ, бета-меркаптоетанол - 2 мМ, ФМСФ -0.2 мМ, NaN3 -
0,02%, у співвідношенні 1:10. У ході послідовних стадій центрифугування були
видалені фракції, що містять розчинні і мембранні білки (інкубація гомогенату в
буфері А, що додатково містив тритон Х-100 - 2%). Після цього осад
ресуспендували в розчині буферу А, у склад якого додавали сечовину - 4 М,
екстракція проходила протягом 18 год. Подальше центрифугування проводили при
100 000 g протягом 60 хв. Отримані фракції використовували для визначення
загальної гепарин-зв'язуючої активності білків.
Для отримання фракції мембраноасоційованих білків мозку новонароджених щурів 30
г тканини гомогенізували у 10 об'ємах трис-НСl буферу - 0,05 М, рН 7,0, що
містив NaCl - 0,15 М, ЕДТА - 1 мМ, соєвий інгібітор трипсину - 1 мМ,
бета-меркаптоетанол - 2 мМ, ФМСФ - 1 мМ, мертиолят - 0,05%, лейпептин - 0,001%.
Після центрифугування при 50 000 g протягом 1 год відбирали супернатант, що
містив фракцію розчинних білків. Осад тричі промивали початковим буфером і
ресуспендували в даному буфері, із кінцевою концентрацією NaCl -2 М, інкубацію
проводили 2 год. Після центрифугування відбирали супернатант, який
використовували для очищення гепарин-зв'язуючих мембраноасоційованих білків.
2.3. Визначення загального білку
Кількість загального білка визначали за методом Бредфорд [121]. Для побудови
калібрувальних кривих за стандарт використовували розчин бичачого сироваточного
альбуміну. Метод кількісного визначення білка за допомогою кумасі діамантового
блакитного G-250 базується на перетворенні помаранчевого кольору барвника в
блакитний при зв’язуванні з білком, при цьому максимум поглинання зміщується
відповідно з 465 на 595 нм. У цьому випадку концентрація зв’язаного барвника
прямо пропорційна концентрації білка в пробі. У кислих розчинах кумасі
діамантовий блакитний G-250 має два негативних заряди, тому легко зв’язує
основні амінокислоти - лізин, аргінін, гістидин. Метод характеризується в
чотири рази більш високою чутливістю ніж метод Лоурі. Забарвлення стабільне
протягом однієї години. У незначній мірі на результати впливають буферні
компоненти з лужними властивостями, трис, оцтова кислота, 2-меркаптоетанол,
сахароза, гліцерин і слідові кількості детергентів. Цей вплив може бути
компенсований шляхом введення відповідних добавок у контрольний розчин.
Мікроваріант методу Бредфорд. Дослідну білкову фракцію або розчин
білку-стандарту вносять до лунки планшету по 20 мкл, після чого додають 200 мкл
розчину барвника. Енергійно перемішують і через 10 хв вимірюють поглинання на
595 - 620 нм.
Реагент – розчин барвника, що складають кумасі діамантовий блакитний G-250
–0,01%, етанол – 4,75%, та фосфорна кислота – 8,5%. Розчин ретельно фільтрують.
Зберігають при температурі 20 оС протягом 2 тижнів.
2.4. Визначення загальної гепарин-зв'язуючої активності білків
Для визначення загальної гепарин-зв'язуючої активності в отриманих білкових
фракціях був використаний твердофазний вуглевод-ферментний аналіз [122]. Цей
метод є модифікацією твердофазного імуноферментного аналізу. Його особливість
складається у використанні кон’югату, що складається з гепарину з нашитою на
нього ферментною міткою.
Кон’югат гепарину із пероксидазою хрону готували за методикою [122]. Гепарин -
2,5 мг/мл, розводили на бікарбонатному буфері - 0,3 М, рН 9,5. З метою
екранування аміногруп, у розчин гепарину додавали спиртовий розчин
динітрофторбензолу (ДНФБ) - 0,01%, у відношенні 1:10 (інкубація 30 хв при
кімнатній температурі). Для кон’югації із молекулами пероксидази хрону частина
карбоксильних груп повинна бути перетворена в альдегідні. Для цього в розчин
вуглеводу додавали рівний об'єм водного розчину перйодату натрію – 80 мМ
(інкубація 30 хв при кімнатній температурі, постійне перемішування). Перйодатне
окислення зупиняли розчином етиленгликолю - 0,16 М (інкубація 60 хв при
кімнатній температурі). Отриманий розчин діалізували проти бікарбонатного
буферу - 10 мМ, рН 9.5. Ліофілізовану пероксидазу хрону розчиняли в отриманому
розчині гепарину в кінцевій концентрації 1,5 мг/мл (постійне перемішування
протягом 5 годин при кімнатній температурі). Пероксидазу, що не зв'язалась з
гепарином, відокремлювали від кон'югату за допомогою гель-фільтрації на
сефадексі G-100.
Для проведення мікрометоду з різними фракціями мозку підібрані оптимальні умови
сорбції та зв’язування сорбірованих білків з гепарином. Аналіз проводили в
плоскодонних 96-луночних планшетах, за наступною схемою:
- сорбція на полістерол планшету дослідної проби, яка розведена в фосфатному
буфері - 10 мМ, рН 7,4 (інкубація 12 год, при 4оС);
- промивка забуференим фізіологічним розчином (ЗФР), що містить твін - 0,05% (3
рази по 5 хв);
- блокування вільних місць зв’язування на полістеролі розчином бичачого
сироваточного альбумін
- Київ+380960830922