РОЗДІЛ 2
МАТЕРIАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
2.1. Рекомбінантні антигени
Як антигени у дослідженнях використані:
- рекомбінантний пластівцевоутворюючий фактор золотистого стафілокока - ПлФ41 з молекулярною масою 42 кДа, синтезований у клітинах E. coli (штам XLI-Blue, що містить плазміду pCF41). Антиген відповідає нативному пластівцевоутворюючому фактору і містить його повний лігандзв'язуючий домен (221-559 амінокислотні залишки), а також фрагмент з 6 залишків гістидину на N-кінці.
- рекомбінантний білок А (БА) S. aureus м. м. 40 кДа, синтезований у клітинах E. coli (штам SpA-1) ("ДіаПроф Мед", Україна). Антиген відповідає нативному БА і містить його повну амінокислотну послідовність.
2.2. Види i штами бактерій, плазміди
Для синтезу рекомбінантного пластівцевоутворюючого фактора використаний штам-продуцент, одержаний на основі реципієнта E. coli XLI-Blue (supE44, hsdR17, recA1, endA1, gyrA96, thi-1, relA1, lac [F,' proAB+, lacIq, lacZ?M15, Tn10 (tetr)]), люб'язно наданий проф. Т. Фостером (Дублін, Ірландія). Штам-реципієнт був трансформований сконструйованою на основі вектора pQE30 ("QIAGEN") плазмідою pCF41, в якій під контролем сукупності промотору фага Т5 [119, 120] та подвійного модуля операторів лактозного оперона міститься ген, що кодує фрагмент пластівцевоутворюючого фактора S. aureus (рис.2.1). Генетичним маркером плазміди pCF41 є ген bla (?-лактамази), що забезпечує стійкість трансформованих клітин до ампіциліну.
Рис. 2.1 Схема плазміди pCF41: PT5 - промотор фага Т5, lac O - оператор лактозного оперона E. coli, RBS - ділянка зв'язування рибосом, ATG - ініціюючий триплет, 6хHis - ділянка, що кодує "блок" залишків гістидину, clf41 - ген, що кодує фрагмент ПлФ, BamHI, HindIII - сайти рестрикції, stop codons - стоп-кодони, Col EI - ділянка ініціації реплікації, Аmpicillin - ген стійкості до ампіциліну (за [14, 119])
Для одержання білків лізату клітин E. coli використовували штам-реципієнт E. coli XLI-Blue.
Штами E. coli M15 (nals strs rifs lac- ara+ gal+ mtl- F'-, recA+, uvr+ lon+), що містить плазміду-репресор pREP4 ("QIAGEN"), та BL21(DE3)Gold (F- dcm ompT hsdS(rb- mb-) gal EndA ?(DE3)) використовували для трансформації плазмідою pCF41 та синтезу рекомбінантного білка.
E. coli XLI-Blue (pCF41) вирощували на середовищах LB, 2YT та М9 з додаванням гідролізату казеїну (до 1 %), дріжджового екстракту (до 0,5 %) і глюкози (до 1 %) при 37 0С та активній аерації до оптичної густини 0,5-0,6 (при ? = 600 нм, ОГ600). Інші штами - на середовищі LB. Інокулят вносили в кількості 2 % від об'єму середовища. Для забезпечення селективного росту клітин, які містять плазміду pCF41, у всі середовища додавали ампіцилін (200 мкг/мл), а при вирощуванні продуцента на основі штаму-реципієнта М15 додатково - канаміцин (25 мкг/мл). Для індукції синтезу рекомбінантного білка додавали ізопропілтіо-?-D-галактозид (ІПТГ, "Pharmacia", Швеція) до концентрації 0,5 мM та вирощували культуру до стаціонарної фази росту. Клітини відмивали в буфері (20 мМ трис-HCl, рН 8,0, 0,5 мM ЕДТА), збирали центрифугуванням та використовували в подальшій роботі.
2.3. Сироватки здорових та хворих
на стафілококову інфекцію людей
Досліджено сироватки крові 69 хворих на остеомієліт віком від 20 до 50 років. Хворі знаходились на лікуванні у клініці кістково-гнійної хірургії інституту травматології та ортопедії АМН України. Сироватки 8 хворих досліджено в динаміці інфекційного процесу.
Досліджено сироватки крові дітей віком 8-16 років із стафілококовою інфекцією верхніх дихальних шляхів (26 зразків), отримані з дитячої лікарні № 5 м. Києва. У всіх 26 хворих був встановлений діагноз гаймориту (з них у 24 хворих був гострий гнійний гайморит, у 2 - рецидивуючий хронічний гнійний гайморит).
Хворих обстежували в перші дні госпіталізації. Кров для IФA брали в перші дні (2-5 дні) надходження хворих до стаціонару. Для дослідження сироваток у період реконвалесценції (після проходження специфічної терапії) кров у пацієнтів брали через 15-30 днів після госпіталізації у клініку. До аналізу сироватки зберігались при -70 0С.
Стафілококова етіологія захворювання встановлювалась на основі клінічних спостережень, даних анамнезу i підтверджувалась виділенням з гнійного джерела золотистого стафілокока з урахуванням його патогенних властивостей та/або за допомогою серологічних досліджень.
Контрольну групу склали 32 клінічно здорові дитини віком 8-16 років, що проходили обстеження у дитячій клінічній лікарні №1 у плановому порядку, та 74 здорових донори віком від 20 до 50 років (сироватки отримані зі станції переливання крові).
2.4. Трансформація E. coli
Виділення плазміди здійснювали за [121], трансформацію проводили за стандартною схемою [122]. Після трансформації суспензію клітин висівали на чашки Петрі з агаризованим LB-бульйоном, (1,5 % агар) [123], що містив ампіцилін у концентрації 50 мкг/мл (а в разі штаму М15 - додатково 25 мкг/мл канаміцину), інкубували при 30 0С протягом 18-24 год. Далі трансформанти відбирали на середовищі із концентрацією ампіциліну 100 мкг/мл. Колонії, що виросли після 18-24-годинної інкубації, переносили в середовище LB, інкубували в аналогічних умовах при аерації та використовували як інокулят для ферментації. Ферментацію проводили як описано в підрозділі 2.2.
2.5. Дослідження динаміки росту культури та оцінка виживання клітин, які містять плазміду
Визначали співвідношення між оптичною густиною (ОГ600) суспензії та кількістю колонієутворюючих одиниць (КУО) в одиниці об'єму. Для цього послідовно розводили клітинну суспензію у фізіологічному розчині (10-1-10-7) і висівали по 0,1 мл із кожного розведення суспензії на агаризоване поживне середовище (LB з 2 % бактоагару) з додаванням антибіотика або без нього та інкубували при 32 0С. Після цього підраховували колонії, що виросли на чашках Петрі, і на основі отриманих даних порівнювали динамі