РАЗДЕЛ 2
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1. Материалы и методы исследований
2.1.1. Материалы и методы экспериментальных исследований. Работа проводилась на самцах инбредной линии крыс WAG/G Lac Sto (Wistar albino Glaxo) массой 180-200 г [236]. Животные содержались в соответствии с нормами GLP [237]. Исследования проводились согласно стандартам GLP [237]. Умерщвление животных проводилось в соответствии с требованиями GLP [237].
Животные были разделены на 6 групп: I-я группа - контрольная (6 интактных животных); II-у группу составляли 18 крыс, которым проводили линейный разрез кожи подлежащей клетчатки и мышцы левого бедра; в III, IV, V и VI группах (по 18 животных) моделировали гнойную рану путем внутримышечного введения в правое бедро смеси микроорганизмов в количестве 16 млрд. КОЕ в 1 мл физиологического раствора (по 8 млрд. стандартного штамма S.aureus и клинического штамма S. pyogenes). Через 2-е суток абсцесс вскрывали. Во всех группах длина раны составляла 0,012-0,017 м. Во II-й и III-й группах лечение не проводилось. В остальных группах животным с гнойной раной 2 раза в сутки внутримышечно в противоположное бедро вводились растворы антибиотиков: в IV-й группе - линкомицин в суточной дозе 300 мг, в V-й - оспамокс 4 мг в сутки, в VI - клацид 4 мг в сутки (дозировка препаратов определялась по весу животного).
До начала экспериментов животных в течение 1-2 недель выдерживали в виварии на обычном пищевом рационе по 10-20 особей в стандартных металлических клетках. Для исключения влияния сезонных и суточных колебаний на изучаемые показатели основные исследования были проведены в осенне-зимний период в утренние часы, опыты осуществляли в соответствии с "Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных" [237]. Животных умерщвляли мгновенной декапитацией под эфирным наркозом. По 6 животных из исследуемых групп выводили из эксперимента на 1-е, 3-и и 7-е сутки после операции.
Материалом для морфологического исследования служили кожа интактных животных, иссеченные ткани в области раны у оперированных крыс, а также печень, почки, селезенка и вилочковая железа животных всех групп. Иссекались кусочки кожи с подкожной клетчаткой и мышцей, перпендикулярно длиннику раны материал фиксировали в 10 % нейтральном формалине; из печени, почек и селезенки двумя продольными разрезами через весь орган иссекали пластину толщиной около 0,004 м. Материал подвергали спиртовой проводке и парафиновой заливке, изготавливали срезы толщиной 5-6 мкм. Обзорные препараты, окрашенные гематоксилином и эозином, использовали для общей оценки состояния исследуемых тканей. Окрашивались препараты фуксином для выявления эластических волокон по Вейгерту с докрашиванием пикрофуксином по Ван Гизон. Окраска по Маллори использовалась для выявления и дифференцировки соединительно-тканных структур. Для оценки функциональной активности регенерирующих тканей использовали комплекс гистохимических методик. Дезоксинуклеопротеиды (ДНК) выявляли реакцией по Фельгену-Россенбеку (контроль - гидролиз с HCl). Рибонуклеопротеиды (РНК) выявляли окраской по методу Браше (контроль кристаллической рибонуклеазой). С помощью ШИК-реакции по Мак Манусу Хочкису (контроль с амилазой) выявляли нейтральные гликозаминогликаны (ГАГ), а Хейл-реакцией с толуидиновым синим - кислые ГАГ (контроль по В.В.Виноградову и Б.Б.Фуксу).
Иммуноморфологическое исследование проводили на парафиновых срезах, толщиной 5-6 мкм непрямым методом Кунса по методике Brosman [174]. Иммунные клетки дифференцировали с помощью крысиных моноклональных антител (МКА) к различным типам клеток фирмы Serotec. Использовали CD8, CD4, CD3, CD18, CD45RA, ED1, IgM, IgG, ИЛ-1?, ИЛ-6, ФНО, ИЛ-2RL, ИЛ-4. Коллагены типировали моноклональными антителами (МКА) к коллагенам I, III, IV и V типов. Рецепторы к эндотелину определяли с МКА к эндотелину. В качестве люминесцентной метки использовали F (ab)-2 - фрагменты кроличьих антител против иммуноглобулинов мыши, меченных ФИТЦ. Препараты изучали в люминесцентном микроскопе МЛ-2 с использованием светофильтров: ФС-1-2, СЗС-24, БС-8-2, УФС-6-3. Относительные объемы основных клонов иммунных клеток определяли с помощью сетки Г.Г.Автандилова [175] в люминесцентном микроскопе. Количество клеток-продуцентов цитокинов подсчитывали в поле зрения х400.
Производили подсчет общего количества лейкоцитов крови и лейкоцитарной формулы по общепринятым методикам.
2.1.2. Материалы и методы микробиологических исследований. Целью наших исследований явилось выделение чистых культур микроорганизмов из гноя больных с гнойно-воспалительными заболеваниями мягких тканей челюстно-лицевой области (флегмона, абсцесс) и их идентификация, а также определение чувствительности выделенных чистых культур бактерий к антибиотикам.
Методика выделения микроорганизмов из гнойной раны
Гной забирали тупфером и помещали один тупфер в пробирку с МПБ для выделения стафилококков, а другой - в сахарный МПБ для выделения стрептококков, затем помещали в термостат на 24 часа при температуре 370С. готовили мазки, окрашивали по Граму и проводили бактериоскопическое изучение в иммерсионном микроскопе. Для определения биохимической ферментативной способности сбраживать углеводы, засевали на среды Гисса (глюкоза, лактоза, маннит, мальтоза, сахароза).
Если выделенный стафилококк образовывал золотистый пигмент, сбраживал маннит, вызывал гемолиз, обладал плазмокоагулирующей и лецитоветилазной активностью, то он был классифицирован как золотистый, патогенный стафилококк (S.aureus).
Стафилококки, образующие белые колонии, не вызывающие гемолиза, не обладающие коагуляционной активностью были отнесены к эпидермальным стафилококкам (S.epidermidis).
После роста посева гноя на сахарном МПБ в термостате при температуре 370С в течение 24 часов, делали пересев на кровяной МПБ для выделения чистой культуры стрептококков. Изучали выросшие колонии, из них готовили мазки, ок