РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ
2.1. Схема дослідів та умови їх проведення
Для виконання поставлених завдань були проведені наступні серії дослідів:
1. Дослідження впливу рентгенівського випромінення у дозах 0,25; 0,5 і 1,0 Гр на гематологічні показники, цитохімічні та біохімічні показники крові на 1-у, 4-у, 7-у і 20-у доби після опромінення. Вивчення протекторних властивостей препарату ерсол за умов опромінення в дозі 0,5 Гр.
2. Дослідження впливу суміші солей важких металів (PbCl2, CuCl2, ZnCl2 у концентраціях, що становить 10 ГДК) на гематологічні показники, цитохімічні та біохімічні показники крові в динаміці. Вивчення протекторних властивостей препарату ерсол за умов інтоксикації.
3. Дослідження поєднаного впливу рентгенівського випромінення у дозі 0,5 Гр і вказаної суміші солей важких металів на гематологічні показники, цитохімічні та біохімічні показники крові в динаміці. Вивчення протекторних властивостей препарату ерсол за даних умов.
Досліди проводили на нелінійних щурах масою 150-200 г, вирощених в умовах віварію [69]. Було сформовано 10 груп тварин, кожна з яких нараховувала по 32 щури. Перша група служила контролем. Щурам 2-ї групи вводили препарат ерсол. Щурів 3-ї, 4-ї і 5-ї груп піддавали одноразовому рентгенівському опроміненню в дозах 0,25; 0,5; 1,0 Гр відповідно. Тварини 6-ї групи зазнавали впливу випромінення в дозі 0,5 Гр на тлі препарату ерсол.
Щури 7-ї і 8-ї груп перорально отримували питну воду з розчиненими в ній солями PbCl2, CuCl2 і ZnCl2 (в концентраціях 1 мг/л, 10 мг/л, 10 мг/л з розрахунку на метал відповідно, що становить 10 ГДК для води водних об'єктів господарсько-питного й культурно-побутового водокористування [174]) протягом 30 діб, однак щури 8-ї групи - на тлі препарату ерсол.
Тварини 9-ї і 10-ї груп зазнавали інтоксикації за попередньою схемою, після чого піддавалися рентгенівському опроміненню в дозі 0,5 Гр. Щури 10-ї групи зазнавали вказаного впливу на тлі ерсолу.
Опромінення здійснювали одноразово за допомогою рентгенівського діагностичного апарату 12 П6 ("Lachema", Чехія) за таких умов: напруга 90 Кв; сила струму 40 мА; фільтр 0,5 мм Сu; шкірно-фокусна відстань 48 см; потужність дози 0,258 мКл/с.
Препарат ерсол (2 % розчин) уводили тваринам внутрішньом'язово, у дозі 150 мг/кг, за день до експерименту та щотижня (на 3-й день) упродовж його. Контрольним тваринам аналогічним чином уводили фізіологічний розчин.
Забій щурів здійснювали під легким ефірним наркозом на 1-у, 4-у, 7-у та 20-у доби після впливу зазначених чинників (по 8 щурів з кожної групи на певну добу забою). Матеріалом досліджень були цільна кров та сироватка крові тварин. Для гематологічного аналізу кров відбирали із хвостової вени щурів. При проведенні досліджень нами виконані вимоги Європейської конвенції про захист хребетних тварин, які використовуються для експериментів та інших наукових цілей (Страсбург, 1985).
У цільній крові визначали загальну кількість еритроцитів, лейкоцитів, тромбоцитів, вміст гемоглобіну, вираховували кольоровий показник крові, середній вміст гемоглобіну в еритроцитах. На мазках крові досліджували лейкоцитарну формулу, вміст інсуліну та катехоламінів в еритроцитах.
У сироватці крові визначали ферментативну активність аспартатамінотрансферази, аланінамінотрансферази, лактатдегідрогенази, лужної фосфатази, вміст загального білка, глюкози, заліза, фосфоліпідів, триацилгліцеролів, холестеролу і загальних ліпідів.
2.2. Методи досліджень
Підрахунок загальної кількості еритроцитів (Т/л), лейкоцитів (Г/л), тромбоцитів (Г/л) здійснювали у лічильній камері Горяєва за загально прийнятими методиками [149, 152, 168].
Кількісне визначення гемоглобіну (г/л) у крові проводили за геміглобінціанідним методом [149]. Гемоглобін при взаємодії із залізосинеродистим калієм окиснюється в метгемоглобін (геміглобін), який з ацетонціангідридом утворює забарвлену сполуку геміглобінціанід, інтенсивність забарвлення якого пропорційна кількості гемоглобіну. Визначення проводили за допомогою набору реактивів фірми "Філісіт Діагностика".
Індекси, які відображають фізико-хімічні властивості еритроцитів (кольоровий показник, середній вміст гемоглобіну в еритроцитах) розраховували за загально прийнятими методиками [149].
Морфологічне дослідження клітин периферичної крові проводили шляхом виготовлення мазків і забарвлення їх за методикою Крюкова-Паппенгайма [149] із наступною мікроскопією під масляною імерсією (окуляр х 7, об'єктив х 90). Розраховували лейкоцитарну формулу, вивчали морфологічні зміни лейкоцитів, підраховували кількість морфологічно-змінених та цитолізованих клітин.
Визначення інсуліну в еритроцитах крові щурів проводили за методикою, розробленою Сандуляком Л.І. [173], за такою схемою:
1. На чисті, сухі предметні скельця наносили краплю крові і виготовляли мазки, які зразу ж опускали у розчин фіксатора (5%-ний розчин калію біхромату, виготовлений на основі 0,9%-ного розчину натрію хлориду) на 14-24 год.
2. Промивали мазки у 3-ох порціях дистильованої води, висушували на повітрі й переносили на 1 хв. в 1%-ний розчин фосфорно-вольфрамової кислоти. Після експозиції мазки знову промивали у 3-ох порціях дистильованої води і висушували на повітрі.
3. Мазки опускали на 20 хв. у розчин паральдегідфуксину, який готували наступним чином: до 730 мл спирту додавали 270 мл дистильованої води і 10 мл концентрованої соляної кислоти. В цій суміші розчиняли 5 г фуксину основного для фуксин сірчистої кислоти (виробництва Угорщини), доливали 10-20 мл паральдегіду (свіжеприготовленого), старанно перемішували і витримували при денному освітленні 7 діб, поки розчин з малинового не перетвориться у фіолетовий.
4. Після забарвлення паральдегідфуксином мазки промивали у 3-ох порціях 70° спирту (у першу порцію додавали 1-2 краплі концентрованої соляної кислоти).
5. Сухі мазки забарвлювали ще 0,1 % розчином еозину.
6. Проводили обезводнення мазків у батареї спиртів зі зрос