РОЗДІЛ 2
НАПРЯМОК, ОБСЯГ ТА МЕТОДИКИ ОБСТЕЖЕННЯ
Аналіз літературних даних свідчить про зростання протягом останніх років кількості хворих з патологією ГБС серед дитячого населення [52-55, 66, 67]. ГБС бере активну участь в підтриманні гомеостазу організму, зокрема, в підтриманні кальцій-фосфорної рівноваги.
Напрямком нашого дослідження було: вивчити поширеність остеопенічного синдрому у дітей з гепатобіліарною патологією залежно від її клініко-патогенетичних особливостей, статі та віку обстежених за допомогою денситометра "Lunar" DPX-А методом двофотонної рентгенівської абсорбціометрії; виявити наявність взаємозв'язку між маркерами резорбції (за рівнем вільного оксипроліну та румалонових антитіл (РмАт) в сироватці крові) і синтезу КТ (за активністю лужної фосфатази (ЛФ) в сироватці крові), а також між індексом маси тіла та станом МЩКТ; розробити алгоритм інформативних критеріїв доклінічної діагностики щодо формування груп ризику за розвитком ОП у дітей при захворюваннях ГБС з метою ранньої діагностики метаболічних порушень в КТ та розробити метод їх корекції.
Для виконання поставлених завдань було обстежено 141 дитину з гепатобіліарною патологією віком від 5 до 15 років. Контрольну групу склали 20 дітей з ІІ-ї А групи здоров'я віком 7-15 років, з них 12 дівчаток та 8 хлопчиків. Усім пацієнтам проводили загальноприйняте клініко-лабораторне обстеження, детально вивчали скарги та анамнез життя, генетичний анамнез. Особливо звертали увагу на масу дитини при народженні, тривалість захворювання ГБС, якість диспансерного спостереження та наявність протирецидивного лікування.
Діагноз патології ГБС встановлювали на основі уніфікованих діагностичних критеріїв, розроблених інститутом педіатрії, акушерства та гінекології АМН України, Національним медичним університетом.
Для верифікації діагнозу та оцінки клінічного перебігу захворювання вивчали симптоматику хвороби з урахуванням фізикальних даних, результатів клінічних і біохімічних дослідженнь крові та сечі, електрокардіографії, ультрасонографії органів черевної порожнини, проведеної апаратом SLE 101 Р, стан слизової оболонки шлунка за допомогою езофагогастродуоденоскопії ендоскопом фірми "Olimpus" GIF типу PQ 20. Пролапс мітрального клапану у дітей підтверджували проведенням ехокардіоскопії. Пацієнти отримували необхідні консультації спеціалістів: ортопеда, отириноларинголога, ендокринолога та інших.
З лабораторних даних більше уваги приділяли показникам біохімічного дослідження, зокрема вмісту в сироватці крові білірубіну (за Ієндрашиком), загального білка (біуретовим методом), активності ЛФ (за гідролізом фенілфосфату методом Горячковского А.М.), АлАТ та АсАТ (за методом Райтмана і Френзеля) [207].
Для вивчення показників кальцій-фосфорного обміну вміст кальцію в сироватці крові та його екскрецію з добовою сечею визначали титрометричним методом з використанням мурексиду, рівень фосфору в сироватці крові та в добовій сечі - за відновленням фосфорно-молібденової кислоти [207].
Маркери дезорганізації КТ вивчали: за рівнем вільного оксипроліну в сироватці крові колориметричним методом Stegeman в модифікації L.Bergman і R.Loxley, який удосконалений М.А. Осадчук та Т.П. Кузнєцовою [208-210], а також за вмістом РмАт за допомогою фотометричної оцінки густини преципітату, що утворювався при осадженні комплексу "антиген-антитіло" в 0,13 % розчині сірчанокислого кадмію [211]. Маркером синтезу КТ служила активність ЛФ, яку визначали за гідролізом фенілфосфату [207].
Стан клітинної ланки імунітету вивчали за вмістом Т-(Е-РУК), В-(ЕАС-РУК) та нульових (О-) лімфоцитів методом N.F. Mendes у модифікації Т.І. Гришина та співав. [212, 213]. Субпопуляції Т-лімфоцитів (Т-хелпери та Т-супресори, відповідно ТР-РУК та ТЧ-РУК) оцінювали за їх чутливістю до теофіліну методом F Shore et al. [214]. При цьому вважали, що теофілінрезистентні лімфоцити (ТР-РУК) - це Т-хелпери, а теофілінчутливі (ТЧ-РУК) - це Т-супресори.
Циркулюючі імунні комплекси (ЦІК) ? антиген+антитіло, виявляли за методикою В.В. Желтвая та К.А. Максимовича [212].
Рівень молекул середньої маси (МСМ) визначали за Габріеля Н.І., Ліпатовою В.І. [216]. При довжині хвилі 280 нм визначали МСМ, які містять ароматичні амінокислоти (МСМ1), серед яких значне місце належить триптофану та тирозину, які входять до складу альбуміну, гамма-глобуліну, колагенових волокон і як пептидний фактор, аналогічні дрібнодисперсним білковим фрагментам сироватки крові. Збільшення цього пулу свідчить про руйнування білків, здебільшого печінкового походження [217, 218]. МСМ, що містять фрагменти нуклеїнових кислот, вищих жирних кислот, їх ефірів, холестерину, фосфоліпідів, тригліцеридів, похідних олігоспиртів та глюкуронової кислоти, вітамінів та ряду не ідентифікованих речовин [219-221], визначали при довжині хвилі 254 нм (МСМ2).
Імунологічне та молекулярно-біологічне дослідження проводилися спільно з лабораторією імуноферментного аналізу (ІФА) та лабораторією полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) лікувально-консультативного центру Тернопільської державної медичної академії ім. І.Я. Горбачевського. За допомогою ІФА визначали HBsAg, HBеAg, анти-HBs Ig M, анти-HBс Ig M, анти-HCV (Cor, NS4a, NS4b, NS3) [222, 223]. Для дослідження маркерів ХГВ і ХГС використовували тест-системи другого і третього поколінь НВК "Препарат" (м. Нижній Новгород, Росія), АТЗТ "Діапроф Мед" (м. Київ) та "Intero" Ltd (м. Київ). Дані тест-системи містили "ІФА-НСV-стрип", "ІФА-HBs-стрип", "ІФА-HBе-стрип" і "ІФА-HBc-стрип", розраховані для первинного аналізу сироватки та плазми крові на наявність антитіл до вірусу ГС і ГВ методом ІФА.
З метою виділення геномів НВV і НСV в обстежених та достовірності ІФА, вибірково дітям з ХГВ та ХГС проводили ПЛР, використовуючи стандартні набори реактивів ("АмплиСенс", "Ампликон") ЦНДІ епідеміології МО Російської Федерації. В основі методу ПЛР лежить ампліфікація визначеної послідовності ДНК в кількості, яка перевищує вихідну в мільйони разів.