РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
2.1. Умови та програма проведення експериментів
Дослідження проводили на безпородних білих щурах-самцях, масою 200-220 г, яких утримували в умовах віварію на однаковому харчовому раціоні відповідно до Європейської конвенції про захист хребетних тварин, які використовуються для експериментальних та наукових цілей [203[S159]] Піддослідних тварин розділяли на такі групи:
1. "контроль",
2. "гемічна гіпоксія",
3. "гемічна гіпоксія + карнозин",
4. "гостра гіпобарична гіпоксія",
5. "гостра гіпобарична гіпоксія + карнозин",
6. "адаптація до гіпобаричної гіпоксії".
Гемічну гіпоксію різного ступеня важкості викликали шляхом внутрішньочеревного введення водного розчину нітриту натрію (NaNO2) з розрахунку 20, 50 і 60 мг на кг маси тварини, розвиток якої контролювали за рівнем метгемоглобіну в крові [44[S160], 45[S161], 100[S162]].
Моделювання гіпобаричної гіпоксії здійснювали у проточній барокамері, обладнаній манометром та запобіжним клапаном. Для поглинання вуглекислого газу, який видихають тварини, в камеру поміщали лужний поглинач. Швидкість компресії та декомпресії становила 0,005 МПа/хв.
Гостру гіпобаричну гіпоксію викликали одноразово, в барокамері створювали парціальний тиск кисню 28 мм рт. ст., що відповідає висоті 11000 м над рівнем моря відповідно [51[S163]]. Адаптацію тварин до гіпобаричної гіпоксії проводили щоденно протягом тридцяти діб для визначення продуктів метаболізму NO в сечі, мозку, серці і м'язах та восьми місяців для визначення експресії гену Mb, у барокамері, де створювали умови розрідженого атмосферного повітря 56 мм рт. ст. (7000 м над рівнем моря), по п'ять годин.
Декапітацію тварин проводили під легким ефірним наркозом через 24 год після останнього сеансу гіпобаричної гіпоксії і через 50 хв після введення NaNO2 у випадку гемічної гіпоксії.
Експериментальні дослідження включали такі основні етапи:
1. Дослідження експресії гену міоглобіну за умов гемічної гіпоксії, гострої гіпобаричної гіпоксії і у випадку введення карнозину та одноразового і довготривалого (вісім місяців) впливу гіпоксичної гіпоксії (7000 м над рівнем моря).
2. Визначення рівня метаболітів оксиду азоту в сечі протягом тридцятиденної адаптації до гіпобаричної гіпоксії (7000 м над рівнем моря), а в тканинах мозку, м'язах та серці на 30-й день адаптації.
3. Дослідження швидкості нітрозилювання та нітритредуктазної активності дезокси-міоглобіну коня in vitro, та вплив карнозину на дані процеси.
4. Дослідження електронних абсорбційних спектрів міоглобіну та карнозину в інфрачервоній ділянці; РНКази, РНК, D-рибози та нуклеозит-5'-трифосфатів в ультрафіолетовій ділянці, та вплив нітрозилювання на спектральні характеристики досліджуваних речовин.
2.2. Схеми введення карнозину піддослідним тваринам
За умов гемічної гіпоксії карнозин вводили внутрішньочеревно в дозі 70 мг на кг маси тіла за 30 хв до декапітації.
За умов гострої гіпобаричної гіпоксії карнозин вводили внутрiшньочеревно з розрахунку 100 мг на кг маси тварин за 30 хв до гіпоксичного стресу [6[S164]].
2.3. Виділення та очистка міоглобіну
Міоглобін виділяли із заморожених скелетних м'язів коня шляхом висолювання з водних екстрактів тканин за допомогою сірчанокислого амонію [104]. Розчини міоглобінів обезсолювали методом гельфільтрації на колонці (співвідношення довжини до діаметру 1:10), упакованій сефадексом G-25 ("Pharmacia") і врівноваженій 0,01М КСl. Швидкість елюції 10-12 крапель за хв. Ступінь очистки контролювали якісною реакцією на іони SO42- концентрованим розчином BaCl2.
Концентрацію Mb визначали спектрофотометричним методом з використанням коефіцієнту поглинання metМb Е502 = 10,2 мМ-1•см-1, Е630 = 3,9 мМ-1 см-1 [21[S165]].
2.4. Визначення експресії гену міоглобіну
2.4.1. Методом дот-гібридизації
2.4.1.1. Виділення сумарної РНК з тканин ссавців. 20 г тканини мозку, серця, скелетного м'яза тварин заморожували в рідкому азоті, розтирали у скляному гомогенізаторі. До гомогенату додавали 4 М розчин гуанідинізотіоцианату в розрахунку 1 мл на 100 мг тканини. Уламки клітин осаджували центрифугуванням (20 хв, 14000 g, 2?С). До надосадової рідини, де містилася РНК, додавали додецилсульфат натрію до кінцевої концентрації 1% і проводили трьохразову депротеїнізацію сумішшю фенол (рН 8,5) : хлороформ : ізоаміловий спирт (50:50:1). З розчину РНК осаджували холодним перегнаним етанолом (96%), якого брали 2,5 об'єми, порівняно з розчином РНК [133].
2.4.1.2. Виділення полі-А-РНК [29[S166]]. Принцип методу полягає в тому, що оліго-(dT), ковалентно зв'язана з целюлозою, утворює ds-гібриди з полі-А-хвостами мРНК при пропусканні розчину сумарної РНК. Препарат сумарної РНК розчиняли в 0,01 М трис-HCl буфері (рН 7,5), який містив 0,5 М KCl, і наносили на колонку (0,5?10 см) з оліго-dT-целюлозою ("Reanal", Угорщина). В якості елюенту використовували 0,01 М Трис-HCl буфер (рН 7,5), який містив 0,1 М KCl. Оліго-dT-целюлозу брали з розрахунку 1мл колонки на 10 мг сумарної РНК. Гібриди утворені оліго-dT і полі-А-РНК, дестабілізували в низькосольовому буфері [30[S167]].
2.4.1.3. Отримання кДНК [29[S168]]. В роботі використовували обернену транскриптазу міелобластозу птахів (AMV). Інкубаційна суміш для синтезу кДНК міоглобіну містила 0,05 М трис-HCl буфер (рН 8,3) з 0,04 М КCl, 6 мМ MgCl2, 4 мМ дитіотрейтолом, 5 мкг/мл оліго(dT10), 100 мкг/мл актиноміцину D, 40 один. мкг/мл ревертази і - по 0,1 мМ dATP, dTTP, dGTP, 0,02 мМ [3H]dCTP (25 Ku•ммоль-1) у випадку низької концентрації попередників, у випадку високої концентрації - по 0,2 мМ кожного із dNTP ([3H]dCTP - 800 імпульсів•хв-1•нмоль-1). Реакцію проводили протягом години при 37?С. Фермент інактивували прогріванням при 95? С протягом 10 хвилин.
2.4.1.4. Визначення концентрації нуклеїнових кислот у розчині проводили фіксуванням оптич