РАЗДЕЛ 2
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Исходя из цели и задач работы, наше исследование включало два основных раздела:
экспериментальный и клинический.
Экспериментальная часть работы была выполнена на базе Института проблем
криобиологии и криомедицины НАН Украины (директор – доктор мед. наук,
профессор, академик АН Украины Грищенко В.И.), совместно с НИИ биологии
Харьковского национального университета им. В.Н. Каразина (директор – доктор
биол. наук. Божков А.И.) и кафедрой патологической анатомии ХМАПО (зав.
кафедрой доктор мед. наук, профессор Садчиков В.Д.).
Лабораторная часть работы выполнена на базе городского иммунологического центра
(заведующая – доктор мед. наук Коляда Т.И.). Обследование и лечение больных
хроническим ГП проведено на кафедре терапевтической и детской стоматологии
Харьковской медицинской академии последипломного образования (заведующая
кафедрой доктор мед. наук, профессор Куцевляк В.Ф.) и на базе областной
стоматологической поликлиники (главный врач Челяпин О.А.).
2.1. Характеристика экспериментальных объектов исследований
Лабораторные животные.
С целью обоснования возможности применения и оценки терапевтической
эффективности препаратов эмбриофетоплацентарного происхождения при ГП у
человека, а также установления дозозависимого эффекта препаратов, необходимо
было подобрать адекватный вид животных для воспроизведения патологической
модели.
Согласно заключению Фармакологической Ассоциации США, крыса является
предпочтительным видом животных для изучения действия лекарственных препаратов,
предназначенных для человека [209-211]. Эксперименты со всеми
иммуномодуляторами, испытанными на крысах, показывают, что иммунная система
этих животных равно или даже более, чем система других видов, чувствительна к
воздействию химических или лекарственных препаратов при применении их в дозах,
сопоставимых с массой тела [210].
На основании этого можно сделать вывод о том, что крыса является подходящей
моделью для иммунофармакологического тестирования и исследования эффективности
терапевтического воздействия препаратов лекарственного назначения.
Для решения поставленных в работе задач проведено экспериментальное
исследование на 69 белых крысах-самках линии Вистар массой 200-220 г, возрастом
8 месяцев [243]. Животных содержали в условиях вивария, рацион включал все
необходимые ингредиенты, однако животным был ограничен прием жесткой пищи, а
также в качестве питьевой воды крысы получали дистиллированную воду с целью
усиления манифестации симптомов ГП путем снижения жевательной нагрузки и
уменьшения поступления в организм минеральных веществ. Для исключения сезонных
и суточных колебаний изучаемых показателей все исследования проводились в
летний период в утренние часы. Эксперименты на животных проводили в
соответствии с «Правилами использования лабораторных экспериментальных
животных», 1984, приложение 4 и Хельсинской декларацией о гуманном отношении к
животным. Все манипуляции с животными выполнены согласно Международным
принципам Европейской конвенции о защите позвоночных животных (Страсбург, 1985
г.).
Донорский материал.
Исходным материалом для получения криоконсервированных препаратов служила
плацента, полученная от здоровых женщин-доноров при проведении операции
кесарева сечения (в сроке 38-40 недель беременности) по медицинским показаниям.
Из числа доноров исключались женщины, имевшие соматическую патологию различного
генеза.
Забор фетального материала проводили на базе 5-го городского клинического
родильного дома г. Харькова, в родильном отделении № 1, согласно требованиям
законодательных актов Украины и Европейской ассоциации тканевых банков с
соблюдением этических и юридических норм.
Препарат проходил тестирование методами ПЦР на отсутствие вируса краснухи,
вируса простого герпеса, сифилиса, ВИЧ-инфекции, вирусного гепатита В и С,
микоплазм, токсоплазм [212] и бактериологическое исследование. Экстракт
плаценты получали методом экстракции БАВ из криоконсервированной плаценты
физиологическим раствором [140].
2.2. Моделирование генерализованного пародонтита у крыс
В работе нами была использована «фосфолипазная» модель ГП, предложенная
Институтом стоматологии АМН Украины (В.М.Зубачик, А.П.Левицкий, О.А.Макаренко,
А.И.Перова, Ю.Г.Чумакова, 1999) [213]. Фосфолипазная модель пародонтита
рекомендована Государственным фармакологическим центром для изучения средств
профилактики и лечения пародонтита [214]. Фосфолипаза А2 является
липолитическим ферментом, который при повышенной концентрации обладает
мембранолитическим действием, а также повышает образование биологически
активных веществ с провоспалительным эффектом.
Фосфолипазу А2 получали из поджелудочной железы свиньи, по методу де Хааса и
др. [215]. Данная методика выделения фермента начиналась с механического
обезжиривания, приготовления и выдерживания гомогената поджелудочной железы в
0,2 М трис-буфере, рН 8,0 в соотношении 1:5 около 20 часов при 22°С. Далее
гомогенат доводили до рН 4,0 и прогревали при 70°С в течение 3 минут. Осадок и
слой жирных кислот удаляли центрифугированием, раствор диализировали против
бидистиллированной воды в течение 20 часов, белки осаждали сернокислым аммонием
при насышении 40 - 60%, далее вновь производили диализ и лиофилизацию
полученного раствора. При проведении электрофоретической идентификации
активности полученного препарата было установлено явное преобладание белка с
массой около 30000 Да, что, предположительно, соответствует димерной форме
панкреатической фосфолипазы А2, имеющей массу 15000
- Київ+380960830922