РАЗДЕЛ 2
ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Для решения поставленных задач выполнены экспериментальные исследования на 80 белых крысах-самках линии Вистар и клинико-лабораторные исследования у 123 больных ГП II-III степени в возрасте от 18 до 64 лет, 60-ти из которых проведено комплексное лечение с хирургическими вмешательствами на пародонте (операция остеогингивопластики).
2.1. Объекты и методы экспериментальных исследований
Эксперимент проведен на 80 белых крысах-самках линии Вистар, в возрасте вначале эксперимента 7 месяцев, средним весом 270,4 г.
В качестве модели остеопороза использована модель "алиментарного остеопороза" [44], которая заключается в содержании животных на пищевом рационе с дефицитом кальция, что, по данным различных авторов, вызывает остеопороз [215, 221, 231].
В стандартном рационе вивария содержание кальция составляет 150 мг, фосфора - 173 мг. Животных опытных групп содержали в условиях зерново-овощной (состав: кукуруза - 20 г, свекла - 6 г, капуста - 3 г на одну крысу), низкокальциевой диеты (НКД) (кальция - 17 мг, фосфора - 50 мг). Предварительными исследованиями показано достоверное снижение плотности костей крыс через 2 месяца содержания на НКД [75].
Через 2,5 месяца содержания крыс в условиях моделирования остеопороза им дополнительно моделировали пародонтит путем введения в корм переокисленного подсолнечного масла из расчета 2 мл на крысу в сутки ("перекисная" модель пародонтита [59]). Окисленное масло готовили следующим образом: рафинированное подсолнечное масло прогревали 40 мин. при температуре 130-150?С, продувая воздух в присутствии катализатора - 0,1 % сульфата меди (CuSО4). Перекисное число рафинированного масла - 0,3; переокисленного - 2,6 (в г йода). Продолжительность моделирования пародонтита составила 3 недели.
Адекватность воспроизведенных моделей остеопороза и пародонтита была проверена на основании биохимических и морфометрических исследований путем сравнения с контрольной группой 1. По 5 крыс групп 1 и 2 были выведены из эксперимента сразу после моделирования патологии.
Далее во всех группах крыс проводили хирургическую операцию на верхней челюсти, которая заключалась в травматическом удалении фрагмента альвеолярного отростка челюсти и дальнейшем закрытии костного дефекта без применения остеопластических материалов (ложнооперированные) и с их применением. Ход операции: под тиопенталовым наркозом у крыс скальпелем разрезали слизистно-надкостничный лоскут сразу за верхними резцами, отслаивали его, обнажали при помощи распатора костную ткань и травматически, при помощи костных кусачек, удаляли фрагмент альвеолярного отростка челюсти. Образовавшийся дефект имитировал потерю костной ткани при пародонтите. Далее в костный дефект помещали различные остеопластические материалы. Рану ушивали с использованием резорбируемых нитей.
В качестве заменителей кости использовали следующие материалы:
- гидроксиапатит гранулированный (ГАП) - "ГАП-99 г" (ЗАО "Полистом", Россия);
- синтетический монофазный ?-трикальциумфосфат - "CERASORB" ("Curasan", Германия);
- коллапан (гидроксиапатит с коллагеном и антибиотиком) - "Коллапан-Л" ("Интермедапатит", Россия);
- коллагеновая мембрана - "HYPRO-SORB F" ("Hypro Otrokovice, s.r.o.", Чехия).
Со следующего дня после операции и на протяжении всего периода реабилитации (6 мес.) крысам групп 3-7 вводили ежедневно внутрижелудочно в виде водной суспензии препарат ЕКСО в дозе 300 мг/кг массы тела крысы для усиления процессов репаративной регенерации пародонтальных структур и профилактики дальнейшего прогрессирования остеопороза, так как ранее изучены его пародонтопротекторные и остеотропные свойства [73, 110, 152].
Таким образом, в зависимости от проведенных вмешательств и использованных остеопластических материалов все крысы были разделены на 7 групп:
1 группа (15 крыс) - контроль 1 - диета вивария, ложнооперированные;
2 группа (15 крыс) - контроль 2 - НКД, пародонтит, ложнооперированные;
3 группа (10 крыс) - НКД, пародонтит, ложнооперированные, ЕКСО;
4 группа (10 крыс) - НКД, пародонтит, операция - ГАП, ЕКСО;
5 группа (10 крыс) - НКД, пародонтит, операция - ГАП + трикальцийфосфат, ЕКСО;
6 группа (10 крыс) - НКД, пародонтит, операция - коллапан, ЕКСО;
7 группа (10 крыс) - НКД, пародонтит, операция - ГАП + трикальцийфосфат + коллагеновая мембрана, ЕКСО.
Животных выводили из эксперимента в несколько этапов:
- через 3 мес. и 1 неделю по 5 крыс групп 1 и 2 для оценки моделей остеопороза и пародонтита;
- через 3 мес. после операции (через 6 мес. и 1 неделю после начала эксперимента) по 5 крыс всех исследуемых групп для оценки влияния остеопластики и введения ЕКСО на состояние костной ткани;
- через 6 месяцев после операции (через 9 мес. и 1 неделю после начала эксперимента) по 5 оставшихся крыс во всех группах.
Крыс умерщвляли под тиопенталовым наркозом (20 мг/кг массы тела крысы), производили забор крови, выделяли блоки челюстей с зубами: верхние челюсти для патоморфологических исследований; нижние - для подсчета степени атрофии альвеолярного отростка по методу Николаевой [104], бедренные кости: в одной определяли плотность [76], в другой - активность щелочной (ЩФ) и кислой фосфатазы (КФ) [72], активность эластазы [243] и общую протеолитическую активность (ОПА) [5]. В сыворотке крови определяли содержание кальция [70], неорганического фосфата [60] и активность щелочной фосфатазы [72].
Морфологическими исследованиями изучались симметричные образцы верхних челюстей крыс, где проводилась и не проводилась операция, включающие зуб, альвеолярный отросток и окружающие мягкие ткани. Иссеченные анатомические образования подвергнуты фиксации 10% нейтральным формалином, декальцинированы в жидкости Эбнерра - насыщенном растворе, состоящем из хлорида натрия, дистиллированной воды и соляной кислоты, после чего были залиты в целлоидин. Целлоидиновые срезы, толщиной 5 мкм, окрашены гематок