РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ
2.1. Об'єкти дослідження
Експерименти щодо визначення можливості застосування МВ вод типу "Нафтуся" (шифр II-a-4-A1Кi-б згідно з [268]) для корекції радіогенних порушень окисного метаболізму проведені на лабораторних нелінійних щурах розведення віварію Інституту експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАН України (ІЕПОР). Вивчення впливу залізовмісних мінеральних вод (шифр II-с-2(10,6)-A1Ке) на перебіг вільнорадикальних процесів і склад периферичної крові опромінених тварин проводили на білих лабораторних щурах-самцях лінії Wistar розведення віварію ІЕПОР.
Дослідження оксидантно-антиоксидантного стану крові дітей, що зазнали опромінення внаслідок аварії на ЧАЕС, виконані на базі кафедри педіатрії №4 Національного медичного університету ім. О.О. Богомольця. В експериментах використовувалась венозна кров дітей, з якої готувався гемолізат.
2.2. Дослідження інтенсивності перебігу пероксидних процесів в системі крові
Інтенсивність перебігу пероксидних процесів в системі крові вивчали за допомогою методу кінетичних хемілюмінесцентних характеристик [269]. Кінетику світіння проб фіксували у вигляді хемілюмінограм на приладі ХЛМ1Ц-01, емісію світла реєстрували за допомогою лічильника фотонів. Гемолізат крові готували розведенням цільної крові в 400 разів дистильованою водою. В кюветі хемілюмінометра до 1,0 мл гемолізату додавали 0,5 мл 3% розчину Н2О2 (фізіологічного ініціатора хемілюмінесценції). Кювети термостатували за допомогою пристрою "Біостат" при 250С.
Рис. 2.1. Характеристики типової хемілюмінограми світіння гемолізату.
Крива кінетики світіння гемолізату крові при індукції хемілюмінесценції за допомогою 3% розчину Н2О2 має два максимуми (рис. 2.1). Перший (швидкий) спалах світіння обумовлюється розкладом Н2О2, виділенням НО2. і .ОН а також додаткових молекул О2 і утворенням пероксидних радикалів RO2. з їх подальшою рекомбінацією. Розвиток другого (повільного) піка пов'язаний з наявністю в системі крові антиоксидантів білкової та ліпідної природи і ендогенних продуктів пероксидного окиснення, які утворюються при метаболізмі а також in vitro в процесі вільнорадикального окиснення з подальшим їх накопиченням в системі.
Згідно з методом кінетичних хемілюмінесцентних характеристик визначали наступні параметри:
1) амплітуду першого (швидкого) спалаху I1;
2) амплітуду другого (повільного) спалаху I2;
3) інтенсивність світіння через 300 с - Iк;
4) час індукції повільного спалаху ?, с;
5) загальну світлосуму ініційованої хемілюмінесценції гемолізату крові за 300 с з моменту введення в кювету пероксиду водню ?300;
6) константи швидкості зміни інтенсивності світіння k1, k2, k3 для ділянок хемілюмінограми І, ІІ, і ІІІ відповідно;
7) загальну світлосуму ініційованої хемілюмінесценції гемолізату крові, до якого додано 0,02 мл плазми крові, за 300 с з моменту введення в кювету пероксиду водню пк?300;
2.3. Визначення антиоксидантної активності плазми крові
Плазму крові отримували методом гравітаційного осадження формених елементів. Антиоксидантну активність плазми крові визначали за допомогою методу індукованої хемілюмінесценції додаванням до кювети з гемолізатом 0,02 мл плазми крові [239] і розраховували за формулою:
АОА =?300 - пк?300х 100 %?300
де АОА - антиоксидантна активність плазми крові, %.
2.4. Визначення швидкості генерування супероксидних радикалів-аніонів
Кількісне визначення швидкості генерування супероксидних радикалів-аніонів проводили за окисненням спінового уловлювача - гідроксиламіну-2,2,6,6-тетраметил-4-оксипіперидину до відповідного стабільного нітроксильного радикала.
Реєстрацію нітроксильних радикалів здійснювали методом електронного парамагнітного резонансу (ЕПР) при 20оС у спеціальних кварцевих кюветах завтовшки 0,5 мм без парамагнетиків [270]. Мікросомальні мембрани включались у реакційне середовище, яке складалось з 2х10-3 моль/л гідроксиламіну, 2х10-4 моль/л НАДФ*Н в 0,05 моль/л фосфатному буфері, рН 7,4, який містив 5х10-4 моль/л диетилентриамінпентаоцтової кислоти. Всі розчини готували на бідистильованій воді, а всі реагенти перекристалізовували.
Спектр ЕПР нітроксильного радикалу є триплетом з фактором спектроскопічного розщеплення g=2,005. Реакція накопичення нітроксильних радикалів у мембранах після включення їх у реакційну суміш проходить лінійно протягом 5 хв. Через певні інтервали часу (40 сек.) проводили послідовну реєстрацію спектрів ЕПР. Будували залежність амплітуди другої компоненти спектра ЕПР нітроксильного радикала від часу. З одержаної залежності розраховували швидкість накопичення нітроксильних радикалів, яка дорівнювала швидкості генерування супероксидних радикалів-аніонів (нмоль/мг білка за хв).
2.5. Визначення активності ферментів антиоксидантного захисту
При визначенні активності супероксиддисмутази за основу був взятий метод, описаний в роботі [271]. Принцип визначення базується на відновленні нітротетразолію супероксидними радикалами, які утворюються при реакції між феназинметасульфатом і відновленою формою нікотинаміддинуклеотиду (НАД.H). Утворення нітроформазану, продукту відновлення нітротетразолію, блокується присутністю в зразку СОД. За кількістю нітроформазану визначали активність СОД. Готували 0,15 М фосфатний буфер, рН 7,8 (4,48 г Na2HPO4, 0,25 г КН2РО4 розчиняли в 500 мл дистильованої води). Інкубаційна суміш складалася з 37 мг ЭДТА-Nа2, 330 мг нітротетразолію блакитного, 55 мг феназинметасульфату, 300 мл фосфатного буферу. За приготування розчину НАД.H 152 мг НАД.H додавали до 100 мл трис-ЭДТА-буферу з рН 8,0 (37 мг, ЭДТА-Na, 24 мг трис в 100 мл дистильованої води). Гомогенат тканини готували з розрахунку: 100 мг тканини на 1 мл трис-HCl буферу, (0,05 М, рН 7,8), і центрифугували 30 хв при 4500 об/хв. В супернатанті визначали СОД. Досліджувана проба складалася з 0,1 мл супернатанту (чи