РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
2.1. Об'єкт дослідження
Дослідження проводили на 165 білих щурах-самцях лінії Вістар, з масою тіла 150-200 г. Щурів утримували в умовах віварію на стандартному харчовому раціоні при нормальному світловому дні.
В ході роботи було проведено субхронічне затруєння тварин протягом місяця. Затруєння проводили в ранкові години до годування тварин. Перед початком експерименту тварин зважували. Досліджувані речовини вводили інтрагастрально (в 1 мл дистильованої води) за допомогою металевого зонду з округлою напайкою на кінці для запобігання пораненню ротової порожнини та глотки щура.
Експериментальні групи (n=5-10):
І - контрольна, щурі одержували 1 мл дистильованої води у вище зазначений спосіб;
ІІ - гербіцид 2,4-Д у дозі 10 мг/кг маси тіла;
III - регулятор росту рослин івін у дозі 50 мг/кг;
ІV - івін у дозі 50 мг/кг на фоні інтоксикації гербіцидом 2,4-Д у дозі 10 мг/кг;
V - сукцинат натрію (25 мг/кг);
VI - гербіцид 2,4-Д (10 мг/кг) з сукцинатом натрію (25 мг/кг);
VII - потейтин у дозі 50 мг/кг маси тіла;
VIII - гербіцид 2,4-Д (10 мг/кг) з потейтином (50 мг/кг);
IX - УДХ кислота (2 мг/кг);
X - гербіцид 2,4-Д (10 мг/кг) з УДХ кислотою (2 мг/кг).
2.2. Характеристика використаних в експериментах речовин
Гербіцид 2,4-дихлорфеноксиоцтова кислота ("Sigma", США);
Регулятори росту рослин: 2,6-диметилпіридин-N-оксид (івін),
потейтин (2,6-диметилпіридин-N-оксид у комплексі з сукцинатом натрію) (Інститут біоорганічної хімії і нафтохімії НАН України);
сукцинат натрію ("Хімлаборреактив", Київ);
препарат урсодезоксихолевої кислоти - урсофальк ("Доктор Фальк", Німеччина);
набори для визначення активності аланінамінотрансферази та аспартатамінотрансферази ("Human", Німеччина).
2.3. Гістологічні методики
Для морфологічних досліджень брали сегмент лівої бокової часточки печінки, який видаляли відразу після декапітації, фіксували та обробляли за традиційними гістологічними методами виготовлення парафінових зрізів.
Зразки тканин печінки фіксували у суміші Буена (пікринова кислота, формалін та оцтова кислота - 15 : 5 : 1) протягом двох тижнів. Далі печінку піддавали зневодненню у розчинах етилового спирту зростаючих концентрацій (60%, 70%, 80%, 90%, 96% і 100% - по 8 годин у кожному розчині). Після цього зразки печінки проводили через дві порції хлороформу (по 10 хвилин, помішуючи), витримували при температурі +36?С у суміші (2:1) хлороформу і парафіну 1 годину, потім 1 годину у суміші (1:2) тих же речовин, у чистому парафіні 40 хвилин при +56?С. Після цього зразки тканини заливали у розплавлений парафін. На санному мікротомі виготовляли зрізи товщиною 6-7 мкм.
Виготовлені зрізи печінки піддавали депарафінуванню (дві порції бензолу по 5 хв.), проведенню по спиртах концентрацій 96%, 90%, 80%, 70%, 70% - до 5 хв., промивали у трьох порціях дистильованої води (по 5 хв.), забарвлювали гематоксиліном Бьомера (3-5 хв.), промивали у проточній холодній водопровідній воді (30 хв.-2 год). Зрізи дофарбовували 0,5%-ним водним розчином еозину (10 сек.), після чого промивали у дистильованій воді. Зрізи забарвлювали оранжем G (5 сек.), знову промивали у дистильованій воді. Далі зрізи швидко зневоднювали у розчинах етилового спирту зростаючих концентрацій (70%, 80%, 90%) далі у 96% та 100% - по 5 хв.), просвітлювали у каїпутовому чи касторовому маслі (20-30 хв.), проводили через три порції бензолу (по 3-5 хв.) та заключали під покривне скельце у канадський бальзам.
Гістологічні препарати аналізували на світлооптичному рівні за допомогою мікроскопів Biolam, Ломо (Росія) та Olympus BX-41 (Olympus Europe GmbH, Японія), при збільшеннях мікроскопу: х 150; х 600; х 1500.
Кольорові мікрофотографії отримували за допомогою цифрової фотокамери Olympus C-5050 Zoom (Olympus Europe GmbH, Японія) та мікроскопа Olympus BX-41 (Olympus Europe GmbH, Японія) при тих же збільшеннях.
2.4. Морфометричний аналіз
Відомо, що зміни цито- та гістологічних характеристик органів і тканин, в т. ч. і печінки, можуть бути кваліфіковані як морфологічні еквіваленти функціональних змін клітин [99; 40; 2].
З метою більш ґрунтовної оцінки функціонального стану печінки застосовували морфометричний аналіз: окремо у центролобулярній та перипортальній зонах печінкової часточки вимірювали площі поперечного перетину гепатоцитів та їх ядер (у мкм2) і визначали відносну кількість (у %) двоядерних та поліплоїдних гепатоцитів у цих зонах.
Стан мікроциркуляторного русла печінки визначали, базуючись на результатах вимірювань діаметру синусоїдів та висоти ядер ендотеліальних клітин.
Про функціональний стан у жовчовидільній системі свідчили дані вимірювання висоти епітеліальної стінки жовчних протоків та площі ядер епітеліальних клітин жовчних протоків.
Вимірювання проводили на мікроскопі Olympus BX-41, з використанням програми Olympus DP-Soft.
2.5. Підготовка препаратів сироватки крові та гомогенату печінки щурів
Забір крові (3-4 мл) проводили шляхом надрізу правої пахової вени наркотизованих ефіром тварин. Зразки крові відстоювались протягом 1 години для відділення формених елементів крові (згустку). Після відділення згустку зразки центрифугували при 1500 g протягом 10 хв. Відбирали супернатант з сироватки крові. Вміст білку у сироватці крові і гомогенаті печінки визначали за методом Лоурі [152].
Для отримання гомогенату брали 2 г печінки дослідних тварин (відмитої від крові перфузією холодного фізіологічного розчину), подрібнювали в чашці Петрі ножицями і гомогенізували у ручному скляному гомогенізаторі в 50 мл середовища: 0,25 М сахароза, 0,025 М Трис-НСl, рН 7.4. Центрифугували 10 хв при 4500 g (ОПН-8, 7000 об/хв). Фільтрували через 4 шари марлі для видалення жирових часточок. Отриманий фільтрат використовували для визначення ферментативної активності в гомогенаті печінки.