РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
2.1. Обгрунтування принципу відбору тварин за віком та статтю
Робота виконана на тримісячних самцях білих лабораторних щурів з фіксованою датою народження. Контрольна група представлена самцями, народженими інтактними самками, а дослідну склали тварини, матері яких впродовж останньої третини вагітності зазнавали впливу щоденного одногодинного іммобілізаційного стресу (усього використано 224 тварини).
Відомо, що більшість функцій в організмі, в тому числі нейроендокринна регуляція та реактивність імунної системи характеризуються статевим диморфізмом. Існує велика кількість доказів того, що механізми адаптації в самок більш досконалі, а резерви системи адаптації - більш потужні, що робить їх значно стійкішими до дії стресорів різного генезу [8, 38]. Тому ми зупинили свій вибір на самцях, оскільки в них наслідки впливу різноманітних несприятливих чинників упродовж пренатального онтогенезу більш масштабні та глибокі [95]. Це пояснюється принаймні декількома причинами.
По-перше, статевий диморфізм має місце у функціонуванні ГГАС. Самки мають вищий конститутивний рівень кортикостероїдогенезу, кортикостерону, та у 2-3 рази вищий вміст катехоламінів й активність відповідних ферментів їх синтезу, більші розміри основного норадренергічного утворення мозку - блакитної плями [9]. Стрес-індукована амплітуда секреції катехоламінів та глюкокортикоїдів також вища в самок [38, 217]. Крім того, в самок відновний постстресорний період перебігав без порушень стероїдного гомеостазу, а в самців спостерігалося сповільнене відновлення резервів гіпофізарно-адренокортикального комплексу. Встановлено також існування статевого диморфізму реактивності імунної системи. У самок має місце вищий рівень імуноглобулінів, більш виражена відповідь на антигени, більша частота автоімунних захворювань, ніж у самців. Спонтанні автоімунні синдроми в мишей превалюють і відрізняються більшою різноманітністю в самок у порівнянні з самцями, а перебіг захворювань модулюється змінами рівня стероїдних статевих гормонів [217].
Більш розвинена в самок щурів і серотонінергічна система мозку [38], яка має виражений імуномодулювальний вплив [24] та зазнає модифікацій при синдромі пренатального стресу [81, 84].
Одним з провідних механізмів пошкоджувальної дії стрес-реакції, в тому числі й при дії пренатальних стресорів, є надмірне посилення вільнорадикальних процесів, ефект яких стримується антиоксидантною системою, що вважається важливим компонентом системи обмеження стрес-реакції. Більша потужність та резервна ємність цієї системи в самок, швидша та активніша мобілізація її під час стресу також є причиною меншої вразливості нейроімуноендокринної системи в порівнянні з самцями [96].
Сукупність названих причин обгрунтовує вибір статі тварин.
Основним аргументом щодо вибору віку тварин є термін дозрівання нейроендокринної системи в самців щурів [95], що приводить його у відповідність із завданням дослідити віддалені результати пренатальних стресових впливів.
2.2. Формування експериментальних груп за реактивністю тварин
Щурів утримували за умов природного фотоперіоду, при кімнатній температурі, на стандартному харчовому раціоні віварію, з вільним доступом до води. Усі втручання та забій тварин проводилися паралельно в дослідній та контрольній групах, зранку, натще, з дотриманням міжнародних принципів Європейської конвенції про захист хребетних тварин, які використовуються для експериментальних та інших наукових цілей (Страсбург, 1985), ухвали Першого національного конгресу з біоетики (Київ, 2000).
Більшість досліджень проведено у весняно-літній період.
Зважаючи на індивідуальну реактивність нейроендокринної та імунної систем [117, 118], для проведення всіх експериментів відбирали середньостійких тварин. Для цього за тиждень до початку досліджень проводили вивчення стійкості щурів до емоційного стресу за поведінкою тварин у відкритому полі (оцінювали латентний період першого руху та виходу в центр, а також рухову активність по периферії і в центрі) [63].
2.3. Модель іммобілізаційного стресу та пренатального стрес-синдрому
Експериментальний пренатальний стрес-синдром відтворювали шляхом щоденної одногодинної жорсткої іммобілізації самок на спині з 15-го по 21-й день вагітності. Початком вагітності вважали наступний день після еструсу за умов виявлення сперматозоїдів у вагінальних мазках [95]. Із самців, народжених самками, які зазнавали іммобілізації, формували дослідні групи. Потомки самок, які не зазнавали дії стресу, склали контрольні групи.
Для вивчення нейроендокриноімунних взаємовідносин була використана експериментальна модель іммобілізаційного стресу, яка за даними літератури дозволяє оцінити вклад різних ланок нейроендокринної та імунної систем у реалізацію стрес-індукованих реакцій [11, 26, 308].
По досягненню трьох місяців частину тварин дослідної та контрольної груп піддавали дії гострого одногодинного або хронічного іммобілізаційного стресу (одногодинний щоденний, протягом 7 діб), після чого вивчали морфо-функціональний стан тимуса, окремі біохімічні зміни в ньому та вміст моноамінів.
2.4. Обгрунтування вибору структур для дослідження
Для дослідження взаємовідносин між функціональним станом тимуса та нейроендокринною системою вміст серотоніну та ?-ендорфіну визначали в перегородці мозку, преоптичній ділянці, медіобазальному гіпоталамусі та ядрах мигдалеподібного комплексу. Структури обрано з урахуванням даних літератури стосовно участі їх нейрохімічних та нейропептидних механізмів у реалізації стрес-реакції, що підтверджено на молекулярному рівні посиленням у них експресії генів раннього реагування [236, 237, 272]. Встановлено, що експресія гена c-fos у мозку починає зростати вже на 5-й - 7-й хв іммобілізації [306]. Найбільш виражене підсилення експресії гена c-fos мало місце в латеральній перегородці, преоптичній ділянці, парав