РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
2.1. Матеріали та обладнання
Використовували бензамідин, лейпептин, апротинін – “Amarsham”, США,
2-меркаптоетанол, деоксихолат натрію – “Merck” (ФРН); ФМСФ – “Calbiochem”
(Швейцарія); додецилсульфат натрію, персульфат амонію – “Bio-Rad” (США); трис
“Sigma” (США); кумасі діамантовий блакитний R-250 та G-250, акриламід, ЕДТА,
TEMED, DMSO, DDT – “Serva” (США); Tween 20, метиленбісакриламід, бромистий
етидій – “Sigma” (США), ТВВ - “Calbiochem” (Швейцарія).
Використовували також HCl, KOH, CH3COOH, KCl, NaCl, NaH2PO4, KH2PO4, СаСl2,
MgCl2, етанол, бромфеноловий синій, гліцин, амінооцтову кислоту вітчизняного
виробництва, кваліфікації о.с.ч.
Середовища для культивування еукаріотних клітинних ліній виробництва
“Invitrogen” (США).
В роботі використовували: центрифуги “Backman L-5”, “Eppendorff 5447R”, рН-метр
“Hanna”, денситометр "Anthos2001", прилад для напівсухого електропереносу
“Trans Blot SD” фірми “Bio Rad” (США) та інші.
2.2. Плазміди, штами дріжджів та бактерій, клітинні лінії ссавців
Плазміди, що використовували у скринінгу методом дріжджової двогібридної
системи: репортерні плазміди pSH18-34 (містить вісім операторних послідовностей
для LexA), pJK101 (ген lacZ знаходиться під контролем двох LexA операторних
послідовностей та використовується для визначення зв’язування “bait” до
операторних послідовностей); тестові/контрольні плазміди pSH17-4 (активаційний
домен GAL4, клонований в pEG202, що використовується як позитивний контроль для
визначення активації транскрипції), pBait (конститутивно експресує LexA-bait,
що специфічно взаємодіє з білком, що експресує pTarget), pTarget (експресує
В42-target білок, що специфічно взаємодіє з білком, що кодується плазмідою
pBait); вектори для “bait” конструкцій рEG202 (містить ДНК послідовність, що
кодує LexA, за якою розташований полілінкер для клонування “bait” білка),
рEG202-NLS (аналогічний рEG202, але містить кодуючу послідовність для сигналу
ядерної локалізації між LexA та “bait” білком); вектор для “prey”-конструкцій
pJG4-5 (містить індукований галактозою GAL4 промотор експресує B42-HA таг,
після якого іде полілінкер для клонування кДНК бібліотек); плазміда для
експресії рекомбінантних білків у клітинах Escherichia coli – pET42а
(“Novagen”, США); плазміда для експресії рекомбінантних білків у клітинах
ссавців - pcDNA3.1(+) (“Invitrogen”, США);
Штами Saccharomyces cerevisiae, що використовували у скринувані кДНК бібліотек
методом дріжджової двогібридної системи : EGY48 (генотип MAT alpha, his3, trp1,
ura3,6LexAop-LEU2), RFY206 (генотип MATa, trp1, his3, ura3, leu2, lys2);
Штами E. colі: КС8 (генотип: hsdR, leuB600, trpC9830, pyrF::Tn5, hisB463,
lacDX74, strA, galU,K); XL-1 Blue (генотип: supE44 hsdRIT recAl endAl gyrA46
thi relAl lac-F[proAB+lacI9 lacZAM15 TnlO(tef)]); XL-10 Gold (генотип: Tetr
D(mcrA)183 D(mcrCB-hsdSMR-mrr)173 endA1 supE44 thi-1 recA1 gyrA96 relA1 lac Hte
[F’ proAB lacIqZDM15 Tn10 (Tetr) Amy Camr]); BL21(DE3)pLysS (генотип: F" ompT
hsdSs (rb- mb-) gal dsm (DE3) pLysS (CamR). Штам DE3 містить DE3 лізоген під
контролем T7 РНК полімерази acUV5 промотору. IPTG є необхідним для індукування
експресії T7 РНК полімерази.
Еукаріотні клітинні лінії: MCF-7 (карцинома молочної залози людини), HEK293
(клітини ембріональної нирки людини), NIH3T3 (клітини фібробластів миші).
2.3. Методи роботи з ДНК
2.3.1. Дизайн олігонуклеотидів. Послідовності олігонуклеотидів розробляли на
основі нуклеотидної послідовності відповідної ДНК матриці з додаванням
послідовностей, що містили сайти ендонуклеаз рестрикції для подальшого
клонування у відповідні вектори. Послідовності, специфічні для додаткового
Myc-тагу, включали в послідовність антисенс праймера в рамці з кодуючою
послідовністю. Температуру плавлення розраховували за стандартною формулою:
T=2(A+T)+A(G+C).
2.3.2. Полімеразна ланцюгова реакція. Полімеразну ланцюгову реакцію
використовували для ампліфікації кДНК вставок для клонування. ПЛР проводили в
50 мкл буфера (10 мМ KC1, 10 мМ (NH4)2SO4, 20 мМ трис-HCl, pH 8,8, 0,1 % Triton
X-100, 2 мМ MgSO4), що містив 0,2 мМ dNTPs, 40 пмоль кожного праймера та 1
одиницю активності полімерази Vent (“New England Biolabs”, США). ПЛР проводили
з використанням ПЛР ампліфікатора фірми “Eppendorf” (США). Зразки спочатку
денатурували при температурі 95°C протягом 2 хв, а надалі кожен цикл складався
із трьох етапів: денатурація ДНК при 94°C протягом 30 сек; гибридизація
праймерів при температурі, яку розраховували для кожного праймера (52-70°C)
протягом 30 с; подовження продукту ПЛР при 72°C протягом 30 с для кожних 500 п.
н. Для ампліфікації фрагментів ДНК проводили 25-30 циклів.
2.3.3. Сайт-спрямоване розщеплення (рестрикція) ДНК специфічними
ендонуклеазами. В роботі використовували ендонуклеази рестрикції виробництва
MBI “Fermentas” (Литва). Рестрикцію проводили з використанням відповідного для
кожної ендонуклеази буфера. 1 мкг ДНК розрізали 5 U ендонуклеази рестрикції в
об’ємі 20 мкл з використанням рекомендованого виробником буфера. Реакційну
суміш інкубували при 37°C протягом 1-2 год, а ДНК фрагменти аналізували методом
ДНК електрофорезу в агарозному гелі.
2.3.4. Електрофоретичне розділення продуктів ПЛР в агарозному гелі. Виділення з
гелю фрагментів ДНК. Електрофоретична рухливість молекул ДНК залежить від
їхнього розміру та концентрації агарози в гелі. Використовували 1% агарозні
гелі, а також 1,5 % гелі для аналізу ДНК фрагментів розміром меншим за 500 п.
н., та 0,8 % гелі для ДНК фрагментів більших за 4000 п. н. Відповідну кількість
агарози додавали до ТАЕ буфера (40мМ трис-ацетат, 1 мМ EДТА) та н
- Київ+380960830922